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細胞屬性：

方法簡介

實驗室分離的兔前列腺上皮采用先蛋白酶消化、后膠原酶-聯合消化并通過上皮細胞專用培養基培養篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

實驗室分離的兔前列腺上皮經PCK免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

細胞簡介：

兔前列腺上皮細胞分離自前列腺組織；前列腺（Prostate）是雄性的性腺器官；前列腺是不成對的實質性器宮，由腺組織和肌組織構成。前列腺如栗子，底朝上，與膀胱相貼，尖朝下，抵泌尿生殖膈，前面貼恥骨聯合，后面依直腸。前列腺腺體的中間有尿道穿過，扼守著尿道上口，所以，前列腺有問題時，排尿首先受影響。前列腺是機體非常少有的，具有內、外雙重分泌功能的性分泌腺。作為外分泌腺，前列腺每天分泌前列腺液，是構成精液主要成分；作為內分泌腺，前列腺分泌的激素稱為“前列腺素"。前列腺上皮細胞與前列腺的功能關系密切，上皮細胞的損傷是前列腺炎的主要病癥，重度的前列腺炎患者的前列腺液內可檢測到脫落的上皮細胞，這是上皮細胞損傷的標志。炎癥發生時，與炎癥相關的一些炎癥因子可能發生變化。因此，體外培養前列腺上皮細胞是研究前列腺炎及前列腺上皮肉瘤等疾病的前提和基礎。前列腺主要特征如下：①前列腺結構和功能活動均受雄性激素的調控；②基底細胞主要表達高分子量細胞角蛋白（CK-5、CK-14），基底上皮細胞可分化成管腔上皮細胞；③前列腺上皮細胞的培養為研究前列腺的許多重要特性以及化學和激素性致癌作用提供了機會。

培養信息：

包被條件：鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態：上皮細胞樣

傳代特性：可傳1-2代

消化液：0.25%

培養條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔前列腺上皮細胞體外培養周期有限；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養，以此保證該細胞的佳培養狀態。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養皿中，將細胞懸液接種于培養皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次3min。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，當出現棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側，以免產生氣泡，封好的爬片平放置于通風廚中晾干。

11. 鏡檢觀察。

細胞培養方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

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