轉染小鼠單核巨噬細胞J774A.1專用轉染試劑方法

原標題：轉染小鼠單核巨噬細胞J774A.1專用轉染試劑方法-上海轉染生物科技有限公司

ZetaLife Advanced DNA RNA Transfection Reagent

儲存條件

4℃保存，拒絕反復凍融。

材料準備

1.siRNA、miRNA或者小分子濃度20 uM /L。

2.質粒DNA 濃度300 ng-2 ug/ul（注意：①溶解于無菌雙蒸水或超純水；②無內毒素 ），推薦500ng/ul左右。

操作步驟

1.提前1天接種細胞：細胞匯合度在60-80%左右（根據不同細胞生長速度需調整起始密度），再進行轉染。

2. 核酸復合物制備：將核酸與轉染試劑按照1:1關系直接混合，用移液器吹吸10-15次混勻，室溫靜止10-15分鐘。

3.在細胞培養基中加入核酸復合物：根據參考用量在細胞中加入核酸復合物，并輕輕混勻；細胞培養基里面可以含有血清。

4.細胞換液：轉染24小時后對細胞進行正常換液，懸浮細胞轉染過程中不用換液。

5.分析結果：質粒DNA轉染48-72小時后熒光檢測轉染效率，48-96小時檢測mRNA或蛋白表達。若進行穩定表達細胞株的篩選，則在轉染后24-48小時左右加入適量的藥物進行篩選。siRNA轉染后9小時熒光檢測轉染效率，48-72小時檢測mRNA或蛋白表達。

注意事項

 1、質粒DNA必須溶解于無菌雙蒸水或超純水，但不能溶解于提取試劑盒提供的Buffer。溶解于Buffer的質粒轉染效率會下降80%左右，甚至會轉染失敗。

 2、質粒必須去除內毒素，內毒素對細胞將產生很大的細胞毒性，會導致轉染效率下降70%-80%左右，甚至導致轉染失敗（推薦使用Qiagen、TIANGEN、Omega去內毒素質粒提取試劑盒）。

 3、復合物的制備過程中是不能用其他任何試劑對核酸或轉染試劑進行稀釋，只需將核酸和轉染試劑兩者按1:1比例直接混合，如果進行了稀釋會導致轉染失。

4、轉染試劑與核酸混勻后用移液器吹打10-15次，室溫孵育10-15分鐘后即可加入細胞培養板。

 5、轉染24小時后進行正常換液，不能像Lipo2000一樣轉染4-6小時后換液。

 6、原代細胞、免疫細胞轉染時，細胞基礎培養基里面不能含有雙抗培養基。

轉染操作流程圖