脫氫抗壞血酸（dehydroascorbate，DHA）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書

微量法 100T/96S

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

AsA 作為植物細(xì)胞一個(gè)重要生理指標(biāo)，其 AsA 的含量、氧化還原狀態(tài)(AsA/DHA 比率)及其合成與代謝相關(guān)酶類活性的變化涉及植物對(duì)一系列環(huán)境脅迫的響應(yīng)。DHA 是AsA 的可逆的氧化型，在生物體內(nèi)，與抗壞血酸共同組成氧化還原系統(tǒng)，具有電子受體的作用。

測(cè)定原理：

DTT 還原DHA 生成AsA，通過(guò)測(cè)定體系中AsA 的生成速率，即可計(jì)算出DHA 含量。

脫氫抗壞血酸含量測(cè)定試劑盒-常備現(xiàn)貨

組成：

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 5ml 蒸餾水充分溶解。

標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1 瓶， 4℃保存。臨用前加入 5.743 ml 蒸餾水充分溶解；吸取 0.1 ml 上述溶液，加入 0.9 ml蒸餾水，混勻，即為 100μmol/L DHA。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

樣品中 DHA 提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心 20min，取上清置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；12000g， 4℃離心 10min，取上清液置于冰上待測(cè)。

3. 血清等液體：直接測(cè)定。

DHA 測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 265 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：依次在微量石英比色皿/96 孔板加入 20μl 標(biāo)準(zhǔn)液、160μl 預(yù)熱的試劑二和 20μl 試劑三，迅速混勻后于 265nm 比色，記錄 10s 和 130s 的吸光值A1 和A2，△A 空白管=A2-A1。

4. 測(cè)定管：依次在微量石英比色皿/96 孔板加入 20μl 上清液、160μl 預(yù)熱的試劑二和 20μl 試劑三，迅速混勻后于 265nm 比色，記錄 10s 和 130s 的吸光值A3 和A4，△A 測(cè)定管=A4-A3。

注意：標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。

計(jì)算公式：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

DHA(nmol/mg prot) =[C 標(biāo)準(zhǔn)液×△A 測(cè)定管÷△A 標(biāo)準(zhǔn)管×V 標(biāo)準(zhǔn)]÷（Cpr×V 樣）

=100×△A 測(cè)定管÷△A 標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

DHA(nmol/g 鮮重) =[C 標(biāo)準(zhǔn)液×△A 測(cè)定管÷△A 標(biāo)準(zhǔn)管×V 標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V 樣÷V 樣總)

=100×△A 測(cè)定管÷△A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

DHA(nmol/10⁴ cell) =[C 標(biāo)準(zhǔn)液×△A 測(cè)定管÷△A 標(biāo)準(zhǔn)管×V 標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V 樣÷V 樣總)

=100×△A 測(cè)定管÷△A 標(biāo)準(zhǔn)管÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

DHA(nmol/ml) =[C 標(biāo)準(zhǔn)液×△A 測(cè)定管÷△A 標(biāo)準(zhǔn)管×V 標(biāo)準(zhǔn)]÷V 樣

=100×△A 測(cè)定管÷△A 標(biāo)準(zhǔn)管

C 標(biāo)準(zhǔn)液：100μmol/L；V 樣總：上清液總體積，1.0 ml=1 ×10^-3 L；V 標(biāo)準(zhǔn)：加入標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.02ml；V樣：加入樣本體積，0.02ml；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣品質(zhì)量（g）。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

DHA(nmol/mg prot) =[C 標(biāo)準(zhǔn)液×△A 測(cè)定管÷△A 標(biāo)準(zhǔn)管×V 標(biāo)準(zhǔn)]÷（Cpr×V 樣）

=100×△A 測(cè)定管÷△A 標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

DHA(nmol/g 鮮重) =[C 標(biāo)準(zhǔn)液×△A 測(cè)定管÷△A 標(biāo)準(zhǔn)管×V 標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V 樣÷V 樣總)

=100×△A 測(cè)定管÷△A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

DHA(nmol/10⁴ cell) =[C 標(biāo)準(zhǔn)液×△A 測(cè)定管÷△A 標(biāo)準(zhǔn)管×V 標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V 樣÷V 樣總)

=100×△A 測(cè)定管÷△A 標(biāo)準(zhǔn)管÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

DHA(nmol/ml) =[C 標(biāo)準(zhǔn)液×△A 測(cè)定管÷△A 標(biāo)準(zhǔn)管×V 標(biāo)準(zhǔn)]÷V 樣

=100×△A 測(cè)定管÷△A 標(biāo)準(zhǔn)管

C 標(biāo)準(zhǔn)液：100μmol/L；V 樣總：上清液總體積，1.0 ml=1×10^-3 L；V 標(biāo)準(zhǔn)：加入標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.02ml；V樣：加入樣本體積，0.02ml；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣品質(zhì)量（g）。

注意事項(xiàng)：

1. 臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存，3 天內(nèi)使用完。

2.zui低檢出限為 10μmol/L。

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