脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）試劑盒說(shuō)明書

微量法 100T/96S

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

DHAR 存在于細(xì)胞質(zhì)、線粒體和葉綠體中。DHAR 催化GSH 還原DHA 生成AsA 和GSSG，調(diào)控細(xì)胞AsA/DHA 比值，是抗壞血酸-谷胱甘tai氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶。提高植物體內(nèi)的 DHAR 活性，可提高植物食品中AsA 含量，進(jìn)而提高植物食品的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

測(cè)定原理：

DHAR 催化GSH 還原DHA 生成AsA，通過(guò)測(cè)定DHA 減少速率，計(jì)算 DHAR 活性。

脫氫抗壞血酸還原酶試劑盒-常備現(xiàn)貨

組成：

試劑三：粉劑×1 瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入 2.5 ml 蒸餾水充分溶解。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 2.5 ml 蒸餾水充分溶解。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

研缽、冰、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

粗酶液提取：

1. 按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；8000g 4℃離心 20min，取上清液置冰上混勻待測(cè)。

3. 血清等液體：直接測(cè)定。

DHAR 測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 265nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。

3. 在微量石英比色皿/96 孔板中依次加入 20μl 試劑三、20μl 試劑四和 140μl 試劑二，最后加 20μl 上清液迅速混勻后于 265nm 比色，記錄 30s 和 150s 的吸光值A1 和A2，△A=A2-A1。

DHAR 活性計(jì)算公式：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(Cpr×V 樣)÷T

= 92×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。

DHAR(nmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 92×△A ÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。

DHAR(nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

= 92×△A ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。

DHAR(nmol/min/ml) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷V 樣÷T

= 92×△A

ε ：AsA 在 265nm 處摩爾吸光系數(shù)為 5.42×10⁴ L/mol /cm；10⁶：摩爾分子換算成微摩爾分子；d：比色杯光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2ml=2×10^-4 L；V 樣：反應(yīng)體系中加入上清液體積，20μl =0.02ml； V 樣總：提取液體積，1 ml；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/ml；W ：樣品質(zhì)量；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(Cpr×V 樣)÷T

= 184×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。

DHAR(nmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 184×△A ÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。

DHAR(nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

= 184×△A ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。

DHAR(nmol/min/ml) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷V 樣÷T

= 184×△A

ε ：AsA 在 265nm 處摩爾吸光系數(shù)為 5.42×10⁴ L/mol /cm；10⁶：摩爾分子換算成微摩爾分子；d：96 孔板 光徑，0.5 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2ml=2×10^-4 L；V 樣：反應(yīng)體系中加入上清液體積，20μl =0.02ml； V 樣總：提取液體積，1 ml；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/ml；W ：樣品質(zhì)量；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min。

注意事項(xiàng)：

臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存，3 天內(nèi)使用完。

脫氫抗壞血酸還原酶試劑盒-常備現(xiàn)貨