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發根(電擊)感受態細胞的實驗操作說明

閱讀:998      發布時間:2024-4-11
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發根農桿菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)農桿菌屬(agrobacterium)的一種革蘭氏陰性土壤細菌,它能夠感染大多數雙子葉植物和少數單子葉植物以及個別裸子植物。
操作說明:
一:0.1cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙醇充分揮發,待乙醇揮發干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。
二:取-80℃保存的農桿菌感受態插入冰中5分鐘,待其融化,加入0.01-1 μg質粒DNA(體積不大于6ul,最好用試劑盒抽提,雙蒸水溶解;轉化效率較高,第一次使用前最好做預實驗確定所加質粒的量),用手bo打管底混勻,立即插入冰中,用200μl槍頭將感受態-質粒混合物快速移到電擊杯中,蓋上杯蓋,空管保留待用。
三:啟動電轉儀,設置參數:C=25μF,PC=200ohm,V=2400V(此參數為Biorad推薦,使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作),將電擊杯從冰中拿出,吸水紙吸干外表面水份,快速放入電轉槽中,啟動電擊,電擊完成快速插入冰中,加入1ml無抗生素的TY,并轉移到感受態空管中,28℃振蕩培養2~3小時。
四:6000rpm離心一分鐘收菌,留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的TY平板上,倒置放于28℃培養箱培養2-3天。
 
 
 

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