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1960年代，由于氣相色譜對高沸點有機物分析的局限性，為了分離蛋白質、核酸等不易氣化的大分子物質，氣相色譜的理論和方法被重新引入經典液相色譜。1960年代末科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開發了世界上*臺液相色譜儀，開啟了液相色譜的時代。液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數，以高壓驅動流動相，使得經典液相色譜需要數日乃至數月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內完成。
工科學生zui常使用的液相色譜的參考書籍1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現代實踐》一書，標志著液相色譜法 (HPLC)正式建立。在此后的時間里，液相色譜成為zui為常用的分離和檢測手段，在有機化學、生物化學、醫學、藥物開發與檢測、化工、食品科學、環境監測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應用。液相色譜同時還極大的刺激了固定相材料、檢測技術、數據處理技術以及色譜理論的發展。
1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面臨著困境，后來的研究人員便采用微粒固定相來突破著一瓶頸。科克蘭、荷瓦斯制備成功薄殼型固定相，這種在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄殼，實現了高速傳質，為液相色譜技術的發展奠定了穩固的基礎。隨著填料粒徑的降低，更高的柱效也得以實現。1960年代研制出氣動放大泵、注射泵及低流量往復式柱塞泵，但后者的脈沖信號很大，難以滿足液相色譜的要求。1970年代，往復式雙柱塞恒流泵，解決了這一問題。1970年代后科克蘭制備出全多孔球形硅膠，平均粒徑只有7μm，具有*的柱效，并逐漸取代了無定形微粒硅膠。之后又制造出的鍵合固定相使柱的穩定性大為提高，多次使用成為可能。1970年后，適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點。1980年后，改善分離的選擇性成為色譜工作者的主要問題，人們越來越認識到改變流動相的組成事提高選擇性的關鍵。