定型內(nèi)胚層高效分化試劑盒

僅用于科學(xué)研究

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品名稱：定型內(nèi)胚層高效分化試劑盒

貨號：RC200123

批號：見包裝

試劑清單：

存儲與有效期：

該試劑盒于-80 ℃保存。所有組分必須避免反復(fù)凍融，在-80 ℃有效期為1年。融化后的*培養(yǎng)基于2-8 ℃保存，穩(wěn)定儲存1-2周。

適用細(xì)胞：

適用于人胚胎干細(xì)胞、人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向定型內(nèi)胚層分化（分化效率大于90%）。

產(chǎn)品介紹

人多能干細(xì)胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）包括人胚胎干細(xì)胞（hESCs）和誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（iPSCs）。體外hPSCs定向肝細(xì)胞、肺細(xì)胞、胰島細(xì)胞等方向分化均需要先分化為定型內(nèi)胚層細(xì)胞（definitive endoderm cells）。定型內(nèi)胚層經(jīng)典的分化方法用時3天，因分化過程中添加高濃度的活化素A（100 ng/ml，Activin A），會導(dǎo)致分化的同時細(xì)胞大量死亡。為提高細(xì)胞存活率，通常會添加一定濃度的血清。但血清成分復(fù)雜，提高細(xì)胞存活率的同時也嚴(yán)重影響分化效率（使用血清后流式檢測定型內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)志物SOX17及FOXA2往往低于50%）。這也最終導(dǎo)致肝細(xì)胞、肺細(xì)胞、胰島細(xì)胞等終末分化細(xì)胞分化效率更低，難以滿足下游實驗的需求。本產(chǎn)品主要針對定型內(nèi)胚層分化過程中細(xì)胞大量死亡和血清導(dǎo)致的分化效率低下進(jìn)行產(chǎn)品優(yōu)化，最終形成了成分確定且無血清的改良配方，明顯降低了誘導(dǎo)過程中的細(xì)胞死亡率，且誘導(dǎo)后流式/免疫熒光檢測定型內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)志物SOX17及FOXA2陽性率大于90%。

操作方法

實驗準(zhǔn)備

• *誘導(dǎo)培養(yǎng)基準(zhǔn)備：

• *誘導(dǎo)培養(yǎng)基解凍：室溫解凍*誘導(dǎo)培養(yǎng)基（RC200123）。融化后輕輕充分搖勻，分裝或直接以使用。分裝后立即存儲于-80 ℃，避免反復(fù)凍融。

• 室溫解凍有利于保護(hù)培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)不被破壞，切不可置于37℃水浴劇烈解凍，解凍后請務(wù)必充分混勻，以保證成分的均勻。

• 使用前準(zhǔn)備：*誘導(dǎo)培養(yǎng)基使用前必須進(jìn)行室溫復(fù)溫。

• 解凍后的*誘導(dǎo)培養(yǎng)基必須充分混勻，2-8℃保存。整個過程確保無菌操作，試劑開封前以75%酒精擦拭表面。*誘導(dǎo)培養(yǎng)基使用前置于室溫環(huán)境復(fù)溫，該操作適用于所有用到*誘導(dǎo)培養(yǎng)基的步驟。

• 自備試劑：

• 多能干細(xì)胞*培養(yǎng)基

• 細(xì)胞消化液

• 無鈣鎂的磷酸鹽緩沖液（DPBS）

操作方法

1. 待分化細(xì)胞接種：分化前一天消化，接種hESCs/iPSCs。以24孔板進(jìn)行誘導(dǎo)分化為例，確保分化開始加入*誘導(dǎo)培養(yǎng)基時細(xì)胞匯合度大于90%，細(xì)胞貼壁時間大約為12-16小時。

2. hESCs/iPSCs 復(fù)蘇后狀態(tài)較差，建議傳代數(shù)次調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)后種板開始誘導(dǎo)分化，建議傳代3次后開始種板誘導(dǎo)分化。細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞培養(yǎng)中需要注意的細(xì)節(jié)，細(xì)胞消化、離心時間等可參考多能干細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)品（RC200120、RC200121、RC200111）的產(chǎn)品說明書。

1. 誘導(dǎo)起始：棄去培養(yǎng)上清，用*誘導(dǎo)培養(yǎng)基輕柔地洗滌細(xì)胞2次。按照培養(yǎng)器皿的參考培養(yǎng)基添加量加入*誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將器皿放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。*誘導(dǎo)培養(yǎng)基的參考添加量為24孔板500 μl/孔、6孔板2 ml/孔、10 cm培養(yǎng)皿15 ml/皿。

3. 再次特別提醒*誘導(dǎo)培養(yǎng)基使用之前必須復(fù)溫。加入*誘導(dǎo)培養(yǎng)基之前必須經(jīng)過*誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗滌，否則會影響細(xì)胞分化。洗滌時盡量*去除胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)基殘留，建議洗滌體積24孔板1 ml/孔、6孔板2 ml/孔、10 cm培養(yǎng)皿8 ml/皿。

1. 換液誘導(dǎo)：誘導(dǎo)24小時后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞。更換新鮮*誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將器皿放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每天換液，繼續(xù)誘導(dǎo)至72小時。

4. 誘導(dǎo)培養(yǎng)會對細(xì)胞進(jìn)行篩選，細(xì)胞死亡為正常現(xiàn)象。經(jīng)過72小時誘導(dǎo)后，細(xì)胞匯合度應(yīng)大于80%。誘導(dǎo)培養(yǎng)基使用之前必須復(fù)溫，提前室溫放置復(fù)溫即可，切不可37℃水浴復(fù)溫。

1. 標(biāo)志物檢測：經(jīng)過72小時誘導(dǎo)，細(xì)胞匯合度大于80%。定型內(nèi)胚層細(xì)胞呈三角形或多角形，流式細(xì)胞術(shù)檢測SOX17陽性率應(yīng)大于90%。

5. 該誘導(dǎo)終點只是其他實驗的起點，誘導(dǎo)終點的細(xì)胞難以長時間穩(wěn)定在該狀態(tài)，需要盡快進(jìn)入后續(xù)實驗（大于72小時細(xì)胞會出現(xiàn)凋亡，因此需要每天固定時間點進(jìn)行實驗），如肝臟細(xì)胞、胰島細(xì)胞、肺細(xì)胞等的誘導(dǎo)分化程序等。

6. 以上所有操作均在無菌細(xì)胞培養(yǎng)室進(jìn)行，細(xì)胞開放操作要在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行；該研究常用的培養(yǎng)器皿包括培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板，也可自行設(shè)計方案使用細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞工廠等，請根據(jù)實驗需要自行選擇；多能干細(xì)胞的初始狀態(tài)對分化的成功至關(guān)重要，請務(wù)必保證初始細(xì)胞未分化。該試劑盒僅用于多能干細(xì)胞向定型內(nèi)胚層分化的研究，用于其他研究時該操作規(guī)程僅作為參考。

細(xì)胞形態(tài)展示：

鑒定結(jié)果：

應(yīng)用示例：

1. 人胚胎干細(xì)胞源肺類器官分化

1. 人胚胎干細(xì)胞源肝細(xì)胞分化

參考文獻(xiàn)

1. Chen, Y; Feng, J; Zhao, S; Han, L; Yang, H; Lin, Y; Rong, Z; Long-Term Engraftment Promotes Differentiation of Alveolar Epithelial Cells from Human Embryonic Stem Cell Derived Lung Organoids, Stem cells and development, 2018, 27(19): 1339-1349.

2. Li, Q; Hutchins, A. P; Chen, Y; Li, S; Shan, Y; Liao, B; Zheng, D; Shi, X; Li, Y; Chan, W; Pan, G; Wei, S; Shu, X; Pei, D; A sequential EMT-MET mechanism drives the differentiation of human embryonic stem cells towards hepatocytes, Nature communications, 2017, 8(1): 1-12.