僅用于科學研究

產品信息

產品名稱：人間充質干細胞培養基

貨號：FY200012

批號：見包裝

試劑清單：

存儲與有效期：

組分A于2-8 ℃保存，組分B于-20 ℃保存。所有組分均須避免反復凍融及復溫，各組分在所需要的溫度下有效期為1年，配制完成的*培養基于2-8 ℃保存，穩定儲存2-3周。

適用細胞：

適用于人骨髓、脂肪、臍帶、羊膜等組織來源的間充質干細胞的原代分離、擴增與傳代培養。

產品介紹

人間充質干細胞培養基是一款具有抗老化作用的人間充質干細胞培養基，含有胎牛血清成分。可應用于人骨髓、脂肪、臍帶等組織來源的間充質干細胞（MSC）的原代分離、擴增與傳代培養，并保持MSC的多種生物學特性及多向分化潛能，培養的MSC能夠具有成骨、成脂、成軟骨的分化能力，正常人骨髓MSC表達CD73、CD90、CD105、CD166，不表達CD11b、CD31、CD34、CD45和HLA-DR。MSC在此培養基條件下不具有無限傳代能力。

操作方法

實驗準備

• 人間充質干細胞*培養基配制：
• 添加劑處理：37℃快速解凍人間充質干細胞培養基添加劑（FY200012-B），時間約為10分鐘。添加劑融化后輕輕充分搖勻，分裝或直接按比例添加到基礎培養基中，分裝后添加劑立即存儲于-20 ℃至-80℃，避免反復凍融。
• 快速溶解有利于保護添加劑中營養物質不被破壞，剛融化的培養基添加劑可能會有溶解不充分，出現類似沉淀物，請務必充分混勻，以保證添加的均勻度。
• *培養基配制：將添加劑以10%比例加入到人間充質干細胞基礎培養基（FY200012-A）中，充分混勻，即配制成人間充質干細胞*培養基（FY200012）。*培養基在2-8℃可穩定儲存2-3周，超過3周的*培養基請謹慎使用。
• 混合成人間充質干細胞培養基后必須充分混勻，2-8℃保存。整個過程確保無菌操作，各試劑開封前以75%酒精擦拭表面。*培養基使用前務必室溫復溫至少30分鐘，該操作適用于下列所有用到*培養基的步驟。
• 自備試劑：
  • 消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他）
  • 無鈣鎂的磷酸鹽緩沖液（DPBS）
  • 細胞凍存液

操作方法（僅供參考，請根據各自實驗需求自行制定操作規程）

• 原代細胞培養（羊水、全血、全骨髓培養發法、酶消化法）：
  1. 該部分以單細胞懸液為操作起始。單細胞獲取方式包括但不限于使用胰酶、膠原酶、分散酶等酶消化法（推薦使用組織細胞消化液RC200104）從脂肪、臍帶、羊膜、皮膚等組織獲得；使用離心法直接從羊水、全血、全骨髓獲得。
  2. 原代接種：以上方法獲得的細胞沉淀，漩渦震蕩使其分散為單個細胞，加入適量的*培養基，充分混勻。200 g離心5-10分鐘。棄去上清，漩渦震蕩使沉淀分散為單個細胞，加入適量的*培養基，充分混勻。按照一定的細胞密度接種與培養器皿中。37℃、5%CO₂、飽和濕度靜置培養48小時。該時間段內請勿移動培養器皿，也無需觀察。48小時后觀察細胞，根據情況選擇半量或全量更換新鮮*培養基。
  3. 換液培養：后每48小時更換新鮮培養基。觀察細胞，棄去原培養上清。若懸浮細胞較多，則可用DPBS輕輕洗滌細胞1-2次。添加新鮮*培養基繼續培養。
  4. 傳代：原代細胞傳代以克隆大小和克隆中心細胞密度為標準。若克隆中心細胞密度較大，則不論整個培養器皿是否長滿均應進行傳代操作。棄去培養上清，加入適量的DPBS，輕輕晃動后棄去DPBS，重復洗滌2-3次。加入適量的0.25%胰蛋白酶消化液（推薦使用間充質干細胞消化液，RC200108）室溫消化2分鐘，加入2倍體積的*培養基終止消化。用移液管、吸管或移液槍頭等輕輕吹打細胞，使細胞從培養皿表面脫落。
• 足量的胰酶消化，室溫消化不宜超過2分鐘，吹打細胞時也不宜力量過大，輕輕吹打即可，不脫落細胞直接丟棄。
  5. 凍存：參照下述“hMSC細胞凍存”。
• 原代細胞培養（組織塊法）：
  1. 該部分以組織塊作為起始。組織塊包括但不限于臍帶、羊膜、皮膚等來源的切成1-3 mm³大小的組織塊。
  2. 原代接種：用緩沖液清洗過的組織塊，用適量的*培養基懸浮，300目無菌濾網過濾或200 g離心5-10分鐘，收集組織塊。用適量的*培養基重新懸浮組織塊，均勻接種于培養器皿中，37℃、5%CO₂、飽和濕度靜置培養。48小時內最hao不要對培養器皿進行任何移動。
  3. 換液：48小時后進行半量或全量更換新鮮*培養基，具體視情況而定。每2天更換新鮮培養液。組織塊周圍有密度較高的細胞時，可以選擇去除組織塊。
  4. 傳代：參照上述“傳代”方法。
  5. 凍存：參照下述“hMSC細胞凍存”。
• hMSC細胞傳代培養（非原代）：
  1. 在顯微鏡下觀察細胞，當細胞融合度達到90%，即可傳代。
  2. 棄去培養上清，加入DPBS溶液清洗1次，加入細胞消化液（推薦使用間充質干細胞消化液，RC200108）使其*覆蓋培養器皿底部。
  3. 室溫孵育1分鐘，輕輕拍打培養器皿，顯微鏡下觀察大部分細胞從培養器皿底部脫落后立即停止消化。
  4. 加入消化液2倍體積的人間充質干細胞*培養基，用移液器輕輕吹打培養器皿地面未*脫離的細胞，使細胞*脫落并均勻分散。
  5. 將細胞懸液轉移到離心管中，200 g離心5分鐘。
  6. 棄上清，加入*培養基，重懸細胞，計數。1：3-1：6比例傳代，均勻鋪在培養器皿中，置于37℃、5%CO₂、飽和濕度培養箱中培養。
• hMSC細胞復蘇：
  1. 從液氮中取出凍存的hMSC細胞，迅速將凍存管/凍存袋放入復蘇裝置或37℃水浴快速融化。
  2. 將解凍后的細胞懸液緩慢加入適量*培養基（凍存體積與培養基的體積比為1：5-1：10）。
  3. 200 g離心5分鐘，棄去上清，加入適量的*培養基重懸細胞。
  4. 將細胞均勻鋪到培養器皿中，搖動培養器皿使細胞均勻分布，37℃、5%CO₂、飽和濕度培養，24小時后觀察細胞狀態。
  5. 24小時后更換新鮮*培養基繼續培養，以后每2天更換新鮮*培養基。
• 細胞傳代所需的時間：2-4天。hMSC消化極易過度，建議稀釋0.25%胰酶消化液一倍，且嚴格控制消化時間，消化時長從細胞接觸胰酶開始不易超過2分鐘。
• hMSC細胞凍存
  1. 細胞達到90%匯合度，棄去原有培養基，DPBS清洗1次。
  2. 加入細胞消化液（推薦使用間充質干細胞消化液，RC200108）使其*覆蓋培養器皿底部，室溫孵育1分鐘，輕輕拍動培養器皿，顯微鏡下觀察大部分細胞從培養器皿底部脫落后立即停止消化。
  3. 加入消化液2倍體積的人間充質干細胞*培養基，用移液器輕輕吹打培養器皿地面未*脫離的細胞，使細胞*脫落并均勻分散。
  4. 將細胞懸液轉移到離心管中，200 g離心5分鐘，棄去上清。
  5. 加入適量細胞凍存液（推薦使用細胞凍存液Ⅱ，RC200106），調整細胞凍存密度在1×10⁶ cells/cm₂左右，每支凍存管分裝0.5-1 ml，使用凍存袋凍存請自行根據需要選擇凍存方案。
  6. 程序降溫儀凍存，或放入凍存盒然后置于-80℃或直接放入-80℃，24小時后轉入液氮中長期保存。
• 此處消化液為胰酶消化液。細胞凍存方法有多種，此處介紹的凍存方法為含有DMSO的凍存方式。其他凍存方式請根據需要自行選擇。
• 以上所有操作均在無菌細胞培養室進行，細胞開放操作要在生物安全柜內進行；培養器皿包括培養皿、培養瓶、培養板、細胞工廠等，請根據實驗需要自行選擇；hMSC切忌消化過度，過度的消化會導致細胞快速老化，且失去部分或全部分化能力；實驗室具體可操作的傳代次數請自行分析判斷，并建議以分化能力進行判別；該培養基僅用于hMSC細胞培養，操作規程僅作為參考。