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血小板衍生生長因子(PDGF)的檢測方法

來源:上海酶聯(lián)第三方檢測中心   2015年08月06日 09:15  

血小板衍生生長因子(PDGF)的檢測:
血小板衍生生長因子(plaetderivedgrowthfactor,PDGF)能刺激成纖維細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的分裂增殖,以及誘導(dǎo)成纖維細胞、血管平滑肌細胞、單核細胞和中性粒細胞趨化。人皮膚成纖維細胞AGl523可作為檢測PDGF誘導(dǎo)細胞株增殖活性的靶細胞。 
1.用含10%FCS的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)AGl523細胞,于檢測前用0.25%胰蛋白酶消化生長的細胞。每個35mm培養(yǎng)皿中加入3X104細胞/2mL,置37~C,5%C02條件下培養(yǎng)養(yǎng)2d,洗去培養(yǎng)液。
2.加入系列稀釋的待測樣品、0.1mg/mL人血清白蛋白、0.02uCi(740Bq)3H-TdR和無血清的MCDBl05培養(yǎng)液,總體積為lmL,繼續(xù)培養(yǎng)48h。
3.吸去上清液,用3~4mL 5%三氯醋酸(TCA)溶液固定細胞10min,吸去TCA并洗滌,室溫自然干燥。
4.加入0.5mL含1%SDS的0.3mol/LNaOH溶解細胞15min,將溶解物轉(zhuǎn)移到液體閃爍管中,加5mL閃爍液,通過p-計數(shù)儀計數(shù)cpm。約3ng/mL(0.1mmol/L)PDGF可誘導(dǎo)50%zui大3H-TdR的攝人。
BALB/c 3T3細胞可作為檢測PDGF促增殖作用的靶細胞,在96孔細胞培養(yǎng)板中進行??刹捎谩疕-TdR摻入法或MTF法等測定增殖細胞數(shù)。但其他細胞因子對3T3細胞也有促增殖作用,可用相應(yīng)的中和抗體作阻斷試驗。 血小板衍生生長因子(Plaet derived growth factor,PDGF)是貯存于血小板α顆粒中的一種堿性蛋白質(zhì)。是低分子量促細胞分裂素。能刺激停滯于G0/G1期的成纖維細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、平滑肌細胞等多種細胞進入分裂增殖周期。血小板衍生生長因子PDGF于1974年發(fā)現(xiàn)的一種刺激結(jié)締組織等組織細胞增長的肽類調(diào)節(jié)因子,因其來源于血小板而得名,正常生理狀態(tài)下存在于血小板的α顆粒內(nèi),當(dāng)血液凝固時由崩解的血小板釋放出來并且被激活,具有刺激特定細胞趨化與促進特定細胞生長的生物活性。此外,在組織受到損傷時巨噬細胞、血管平滑肌細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、胚胎干細胞等也可以合成并釋放PDGF。肝臟受損時,巨噬細胞、血小板、浸潤的炎細胞、受損的內(nèi)皮細胞及激活的肝星形細胞均可以分泌PDGF。以自分泌、旁分泌的方式發(fā)揮作用。結(jié)合的PDGF是分子量為30KD的熱穩(wěn)定糖蛋白,是靠二硫鍵相連的A、B兩條多肽鏈組合成的二聚體

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