分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用于核酸、蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。我們實驗室主要是用來測物質的光度以求得物質的濃度或者酶活。

基本原理

分子的紫外可見吸收光譜是由于分子 中的某些基團吸收了紫外可見輻射光后，發生了電子能級躍遷而產生的吸收光譜。它是帶狀光譜，反映了分子中某些基團的信息，可以用標準光譜圖再結合其它手段進行定性分析。

朗伯-比爾定律：當一束平行單色光通過含有吸光物質的稀溶液時，溶液的吸光度與吸光物質濃度、液層厚度乘積成正比，即

                              A= kcl

   式中比例常數k與吸光物質的本性，入射光波長及溫度等因素有關。c為吸光物質濃度，l為透光液層厚度。

組成

  各種型號的紫外－可見分光光度計，就其基本結構來說，都是由五個基本部分組成，即光源、單色器、吸收池、檢測器及信號指示系統。

1.光源

在紫外可見分光光度計中，常用的光源有兩類：熱輻射光源和氣體放電光源。       

熱輻射光源用于可見光區，如鎢燈和鹵鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區，如氫燈和氘燈。

2．單色器

單色器的主要組成：入射狹縫、出射狹縫、色散元件和準直鏡等部分。

單色器質量的優劣，主要決定于色散元件的質量。色散元件常用棱鏡和光柵。

3.吸收池

吸收池又稱比色皿或比色杯，按材料可分為玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外區。吸收池的種類很多，其光徑可在0.1~10cm之間，其中以1cm光徑吸收池zui為常用。

4、檢測器

檢測器的作用是檢測光信號，并將光信號轉變為電信號。現今使用的分光光度計大多采用光電管或光電倍增管作為檢測器。

5、信號顯示系統

常用的信號顯示裝置有直讀檢流計，電位調節指零裝置，以及自動記錄和數字顯示裝置等。

操作步驟

操作之前

1.1　開啟電源進行初始化

開啟主機電源，分光光度計將按屏幕所顯示的項目進行自檢和初始化，如下圖所示。所有項目檢測完畢，初始化結束，整個過程大約需要4min（若使用多池檢測需5min）。每個項目進行初始化操作時將被加亮顯示，當初始化完成后，該項右邊的星標也將加亮顯示。但是，如果檢測到任何異常，初始化過程將立即中止，星標也不會加亮顯示。

1.2　屏幕顯示和觸摸鍵盤

UV-1700的觸摸鍵盤圖可用數字鍵0~9和功能鍵F1~F4選擇不同屏幕中的模式和設置。選擇時，按下相應的數字鍵或功能鍵即可，無需按ENTER鍵確認。此外，輸入數值時，如波長設置或顯示模式等，必須按ENTER鍵確認輸入值。

下面介紹每個鍵的基本功能，在不同屏幕下有一些鍵可能被賦予特殊的功能。

①   START/STOP鍵

　　一旦參數設置完成，可用該鍵開始和停止測量過程。

②   AUTO ZERO鍵

按該鍵，當前波長的吸光度自動調整為0（100%T）。測量前，必須確保在樣品側和參比側中都放有盛有空白的比色池。

③   GOTOWL鍵

該鍵可用來改變當前的波長。

④   ENTER鍵

輸入數值后，按該鍵確認。

⑤   Cursor光標鍵（＜（-），＞）

這組鍵可控制液晶顯示屏幕中光標的左右移動。輸入數值時，左光標鍵還可以用來輸入負值（-）。

⑥   Function功能鍵（F1~F4）

這組鍵的功能與液晶顯示屏幕下方所顯示的功能相對應。

⑦   RETURN鍵

按下該鍵可返回當前屏幕的前一屏。

⑧   MODE鍵

用該鍵可從每種測量模式的參數設置屏返回到主模式屏。

⑨   Print打印鍵

用該鍵可輸出當前屏幕顯示的硬拷貝。

⑩   Numeric數字鍵

用該鍵可輸入數值。

?   CE鍵

用該鍵可清除數值輸入錯誤。按該鍵，已輸入的數值將被清除，可重新輸入正確的數值。

模式選擇和共享操作

初始化完成后即顯示模式選擇屏幕

各種模式概述：

在模式選擇屏幕下選擇各種測量模式，即顯示各自的參數配置屏幕。

①   光度模式

在固定波長下測量樣品的吸光度或%透光率。

②   光譜模式

掃描波長范圍以測量隨波長變化的樣品的吸光度和%透光率。也可進行單光束能量測量。對測得光譜可進行數據處理，如峰檢出、平滑處理和數學計算等。

③   定量模式

用標準樣品建立校正曲線，并對未知樣品進行定量測量。

測量方法有：1、波長法；2、波長法；3、波長法；4、微分定量法。另外，可用下列方法建立校正曲線：K-系數法、單點校正曲線法、多點校正曲線法。

④   動力學模式

由吸光度隨時間的變化計算酶的活性。

若使用多池支架（可選配），zui多可測量16個樣品。以下是可供選用的測量方法：

1、波長動力學測量；2、波長動力學測量；3、多池動力學測量；4、速率測量。

⑤   時間掃描模式

該功能用于測量固定波長下吸光度、透光率或能量隨時間的變化。使用多池支架（可選配）zui多可測量16個樣品，還可以對測得數據進行數學計算等數據處理。

⑥   多組分測量模式

可定量分析zui多8種組分的樣品。使用每種組分的純品作標準樣品，制作校正曲線，進行定量測量。

⑦   光度測量（多波長）

zui多可8個任意波長，然后分別測量每個波長處的吸光度和透光率。測得吸光度后，可選擇三個計算式中的一個，對zui多為四個波長下的測得數據進行計算，并輸出測量結果。

·2波長處測得值間的比值/差值和3波長測量值的計算

·用四數據計算式進行計算：(K1A1+K2A2+K3A3+K4A4)×K5

·用四數據計算式進行計算：K5×(K1A1+K2A2)/(K3A3+K4A4)

Kn：相關系數；An：吸光度。

⑧   可選配程序包

使用可選配程序包時選用此模式。可選配DNA/蛋白質程序包。

⑨   公用模式

在該模式下可設置和改變儀器的基本操作參數。

光度測量

操作步驟如下：

1、在模式選擇屏幕中選擇＜1. Photometric光度＞選項，將顯示參數配置屏幕。

2、用GOTOWL鍵設定測量波長。

3、按F2鍵設定進樣控制。

3、按START/STOP鍵時，測量開始，顯示測量屏幕。

4、如需做空白校正，應在測量前先設置空白樣品，然后按AUTOZERO鍵，將測量值置為0ABS（100%）。

注意事項

?    1、比色皿使用時注意不要沾污或將比色皿的透光面磨損，應手持比色皿的毛面。

?    2、待測液制備好后應盡快測量，避免有色物質分解，影響測量結果。

?    3、測得的吸光度A控制在0.2~0.8之間，超過1.0時要做適當稀釋。

?    4、開關試樣室蓋時動作要輕緩。

?    5、不要在儀器上方傾倒測試樣品，以免樣品污染儀器表面，損壞儀器。

?    6、比色皿在盛裝樣品前，應用所盛裝樣品沖洗兩次，測量結束后比色皿應用蒸餾水清洗干凈后倒置晾干。若比色皿內有顏色掛壁，可用無水乙醇浸泡清洗。

?    7、向比色皿中加樣時，若樣品流到比色皿外壁時，應以濾紙點干，鏡頭紙擦凈后測量，切忌用濾紙擦拭，以免比色皿出現劃痕。

?    8、測定紫外波長時，需選用石英比色皿。

?    9、測量過程中不可打開測量室的窗門，否則會影響測量結果的準確性。

維護和保養

?    1、儀器使用一定周期后,內部會積累一定量的塵埃,由維修工程師或在工程師指導下定期開啟儀器外罩對內部進行除塵工作,同時將各發熱元件的散熱器重新緊固,對光學盒的密封窗口進行清潔,必要時對光路進行校準,對機械部分進行清潔和必要的潤滑,zui后,恢復原狀,再進行一些必要的檢測、調校與記錄.

?    2、環境中的塵埃和腐蝕性氣體亦可以影響機械系統的靈活性、降低各種限位開關、按鍵、光電偶合器的可靠性,也是造成必須學部件鋁膜銹蝕的原因之一.因此必須定期清潔,保障環境和儀器室內衛生條件,防塵.

?    3、溫度和濕度是影響儀器性能的重要因素.他們可以引起機械部件的銹蝕,使金屬鏡面的光潔度下降,引起儀器機械部分的誤差或性能下降;造成光學部件如光柵、反射鏡、聚焦鏡等的鋁膜銹蝕,產生光能不足、雜散光、噪聲等,甚至儀器停止工作,從而影響儀器壽命.維護保養時應定期加以校正.應具備四季恒濕的儀器室,配置恒溫設備,特別是地處南方地區的實驗室.