建立一種體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的人類胎兒腎臟類器官（hFKOs）模型，用于模擬人類早期腎臟發(fā)育和疾病，解決現(xiàn)有誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）來源腎臟類器官（iPSC-KOs）成熟度不足、異質(zhì)性高的問題。

? 一、倫理與樣本獲取

• 倫理批準(zhǔn)：研究遵循《赫爾辛基宣言》，經(jīng)Shamir醫(yī)學(xué)中心與Sheba醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：0132-18-ASF）。

• 樣本來源：15–20周人工流產(chǎn)胎兒腎臟組織，經(jīng)患者書面知情同意。

? 二、組織處理與單細(xì)胞懸液制備

1. 組織清洗與稱重

• 用PBS沖洗胎兒腎臟組織。

• 稱量組織重量，記錄。

2. 機(jī)械切割

• 將組織剪成約1 mm3小塊，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中。

3. 酶消化

• 酶液：0.1% Collagenase IV（Worthington Biochemical）溶于IMDM培養(yǎng)基。

• 條件：37°C，持續(xù)震蕩消化25–50分鐘（視組織量調(diào)整）。

• 終止：加入含10% FBS的DMEM/F12終止消化。

4. 過濾與離心

• 用100 μm細(xì)胞篩過濾，收集單細(xì)胞懸液。

• 400 g離心5分鐘，棄上清。

5. 紅細(xì)胞裂解

• 加入1× RBC裂解液（BioLegend），室溫避光孵育12分鐘，期間輕搖。

• 加PBS稀釋，400 g離心5分鐘，棄上清。

6. 細(xì)胞計(jì)數(shù)與凍存（可選）

• 用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞。

• 可凍存于液氮（NutriFreez D10凍存液）備用。

  

? 三、hFKOs構(gòu)建與培養(yǎng)

1. 基質(zhì)膠準(zhǔn)備

• 基質(zhì)：Cultrex BME（R&D Systems），4°C解凍，保持液態(tài)。

• 細(xì)胞密度：1000 cells/μL（每50 μL BME含5×10?細(xì)胞）。

2. 接種

• 將細(xì)胞-BME混合液滴加于24孔板（50 μL/孔）。

• 固化：37°C孵育10–15分鐘至BME凝固。

3. 培養(yǎng)基添加

• 培養(yǎng)基：hNPSR（人腎單位祖細(xì)胞維持培養(yǎng)基），組成如下：

• 初始培養(yǎng)：每孔加250 μL hNPSR，含ROCK抑制劑（前3–5天）。

• 換液頻率：每2–3天換液一次。

  

? 四、傳代與長(zhǎng)期培養(yǎng)

1. 傳代時(shí)機(jī)

• 每2–3周傳代一次，或當(dāng)類器官充滿視野時(shí)。

2. 消化與傳代

• 機(jī)械消化：用PBS沖洗后，加500 μL冰DMEM/F12，用BSA處理的1000 μL槍頭吹打至類器官碎裂。

• 收集：將懸液轉(zhuǎn)移至15 mL管，冰浴40分鐘（使BME溶解）。

• 離心：4°C，400 g，5分鐘，棄上清。

• 重懸：用新鮮BME重懸細(xì)胞（1:2傳代比例），重復(fù)接種步驟。

? 五、凍存與復(fù)蘇

1. 凍存

• 消化后類器官重懸于NutriFreez D10凍存液。

• 程序降溫盒-80°C過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮。

2. 復(fù)蘇

• 37°C水浴快速解凍。

• 用BME重懸，按常規(guī)方法接種。

? 六、功能驗(yàn)證與下游實(shí)驗(yàn)

1. 形態(tài)觀察

• 明場(chǎng)顯微鏡監(jiān)測(cè)類器官形態(tài)（卷曲/囊性）。

• 免疫熒光檢測(cè)標(biāo)志物（如NCAM1、PAX2、LTL、SYNPO等）。

2. 功能測(cè)試

• Forskolin刺激實(shí)驗(yàn)：25 μM forskolin處理，觀察類器官腫脹反應(yīng)（提示CFTR功能）。

3. 單細(xì)胞測(cè)序

• 用Dispase+TrypLE消化至單細(xì)胞，進(jìn)行10x Genomics單細(xì)胞RNA測(cè)序。

  

? 七、關(guān)鍵試劑與耗材清單

? 流程圖總結(jié)

Kirkstall Quasi Vivo®類器官串聯(lián)3D仿生共培養(yǎng)系統(tǒng)

01

儀器設(shè)備的功能用途

又稱為微流體“芯片上器官”系統(tǒng)，具有相互連接的細(xì)胞培養(yǎng)單元，為類器官生長(zhǎng)提供更具生理相關(guān)性的體內(nèi)微環(huán)境。

通過提供一種近生理的體外模型，模擬細(xì)胞微環(huán)境，具有更完整的結(jié)構(gòu)和功能，解決動(dòng)物與人類之間的種屬差異，且可在體外模擬多種器官特異性疾病狀態(tài)，反映藥物在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律和人體器官對(duì)藥物刺激的真實(shí)響應(yīng)，捕捉復(fù)雜的生理學(xué)反應(yīng)，并滿足高通量的要求。它是一個(gè)多室流動(dòng)系統(tǒng)，為類器官培養(yǎng)提供了一個(gè)緊湊、易于使用的解決方案，包括3D、屏障，或多器官。在疾病模型，藥物篩選和毒性測(cè)試，再生醫(yī)學(xué)和組織工程，發(fā)育生物學(xué)研究，感染與免疫研究，個(gè)性化醫(yī)學(xué)，癌癥研究等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。

兼容多種細(xì)胞來源，包括原代細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）、類器官和細(xì)胞系等，也可以引入健康細(xì)胞、患病細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞。

02

性能特點(diǎn)

Quasi Vivo® 作為一種先進(jìn)的仿生多功能類器官串聯(lián)培養(yǎng)系統(tǒng)，專門設(shè)計(jì)用于解決學(xué)術(shù)和工業(yè)研究人員在開展體外和體內(nèi)研究時(shí)遇到的主要問題，具有下列性能優(yōu)勢(shì)：

1.功能延展性強(qiáng)

可選擇氣液界面、液液界面、支架和流動(dòng)方案的多樣化培養(yǎng)方式；

允許獨(dú)立、可控的空氣、氣體或液體層流流向頂端和基底外側(cè)；

滿足多器官/多細(xì)胞串聯(lián)共培養(yǎng)，細(xì)胞間的信號(hào)傳遞等實(shí)驗(yàn)要求。加速類器官細(xì)胞分化和成熟，提高細(xì)胞活力，適合長(zhǎng)期培養(yǎng)。

2.成像友好

配備了光學(xué)窗口在頂部或底部表面，便于理想的實(shí)時(shí)高分辨率成像。

3.易于獲取樣本

直接收集樣本和獲取組織或液體樣本。

4.模擬生物力學(xué)和濃度梯度

   嚴(yán)格控制多個(gè)變量，可以模擬生理特征，如血液循環(huán)，組織間液流動(dòng)態(tài)等，為細(xì)胞提供生物力學(xué)信號(hào)；可以實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞共培養(yǎng)以及血管化等復(fù)雜疾病模型構(gòu)建；用于研究多種生理過程，如細(xì)胞遷移、分化、免疫反應(yīng)以及癌癥的轉(zhuǎn)移等。

5.便攜和易于操作

緊湊型模塊化腔室結(jié)構(gòu)，具有更高人體生理相關(guān)性；

占地面積小，節(jié)省空間，可兼容標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的孵化器。

產(chǎn)品用戶概況

全球使用Kirkstall Quasi Vivo® 動(dòng)態(tài)多功能仿生類器官串聯(lián)培養(yǎng)系統(tǒng)的學(xué)術(shù)及研究機(jī)構(gòu)已超過100+個(gè)，遍布美國(guó)、英國(guó)、法國(guó)、瑞典、奧地利、意大利、荷蘭、瑞士、日本等。目前該系統(tǒng)被成功用于下列三維細(xì)胞類器官培養(yǎng)：

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