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細胞接種：根據實驗目的，將處于對數生長期的細胞用胰酶消化后，調整細胞懸液濃度，接種于 96 孔細胞培養板中，每孔接種體積通常為 100 μL，細胞接種數量根據細胞類型和實驗要求確定，一般為 1×103 - 1×10?個 / 孔 。將培養板置于細胞培養箱中（37℃，5% CO?），培養 24 小時，使細胞貼壁或適應懸浮培養環境。
藥物處理（如需）：若實驗涉及藥物處理，在細胞培養 24 小時后，向各孔中加入不同濃度梯度的藥物溶液，同時設置空白對照組（只加培養基）和陽性對照組（加入已知具有細胞毒性的藥物），每組設置 3 - 5 個復孔 。將培養板繼續置于細胞培養箱中孵育相應時間（根據實驗設計確定，一般為 24 - 72 小時）。
加入 CCK-8 試劑：孵育結束后，每孔加入 10 μL CCK-8 試劑，輕輕振蕩培養板，使試劑與培養基充分混勻 。將培養板放回細胞培養箱中，繼續孵育 1 - 4 小時。在此過程中，可每隔 1 小時觀察一次，當甲臜顏色達到合適深度且吸光度值處于檢測線性范圍內時，停止孵育。
吸光度測定：使用酶標儀在 450nm 波長處測定各孔的吸光度值（OD 值）。若樣本背景值較高，可同時測定 600 - 650nm 波長處的吸光度值，用 450nm 處的 OD 值減去 600 - 650nm 處的 OD 值，以消除背景干擾 。
細胞狀態把控：確保用于實驗的細胞處于良好的生長狀態，選擇對數生長期的細胞進行接種，避免使用老化或生長異常的細胞，否則會影響細胞活力檢測結果的準確性 。在細胞傳代過程中，嚴格控制傳代次數，一般建議在 10 代以內使用。
試劑使用規范：CCK-8 試劑應避光保存于 4℃冰箱中，使用前需平衡至室溫。避免試劑反復凍融，以免影響 WST-8 的活性 。使用時，盡量減少試劑在空氣中的暴露時間，防止被氧化。
孵育條件優化：CCK-8 試劑的孵育時間會因細胞類型、細胞密度和代謝活性的不同而有所差異。對于代謝較慢的細胞，可能需要適當延長孵育時間；而對于代謝旺盛的細胞，孵育時間可適當縮短 。在進行新的細胞系檢測或開展預實驗時，建議設置不同的孵育時間梯度，確定最佳孵育時長。
避免干擾因素：實驗過程中，應避免使用含酚紅的培養基，因為酚紅在 450nm 波長附近有吸收峰，會干擾甲臜的吸光度測定 。若必須使用含酚紅的培養基，需設置空白孔（只加培養基和 CCK-8 試劑）進行對照，以扣除酚紅的影響。此外，一些具有還原性的化合物（如維生素 C、DTT 等）可能會與 WST-8 發生反應，導致吸光度值異常，在藥物處理實驗中需注意藥物成分對檢測結果的潛在干擾。
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