在細(xì)胞體外培養(yǎng)中，污染如同潛伏的“隱形殺手”，時(shí)刻威脅著實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性。在最常見(jiàn)的三大污染源——支原體、細(xì)菌和真菌中，支原體污染以 30%-60% 的超高污染率，成為科研人員最頭疼的難題之一。本期細(xì)胞學(xué)堂，我們將全-方位解析支原體污染的防治要點(diǎn)，助你輕松應(yīng)對(duì)這一實(shí)驗(yàn)室“頑疾”，為細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。

自然界中支原體種類(lèi)超過(guò)120種，而細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)污染菌株主要包括牛精氨酸支原體、發(fā)酵支原體、豬鼻支原體、人口腔支原體、牛無(wú)膽甾支原體等。這些菌株污染細(xì)胞后，會(huì)引發(fā)細(xì)胞一系列特征性改變，包括：

這些變化缺乏特異性，但會(huì)干擾細(xì)胞正常生理狀態(tài)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果失真甚至錯(cuò)誤。由于支原體的直徑僅0.1-0.3 μm，遠(yuǎn)小于常規(guī)細(xì)胞，且無(wú)細(xì)胞壁，折光性極低，因此難以通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡識(shí)別。加之其對(duì)青霉素等常用抗生素具有耐藥性，進(jìn)一步增加了污染檢測(cè)和清除的難度。因此，上述細(xì)胞表型的異常改變往往成為污染的早期預(yù)警信號(hào)—— 當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)不明原因的生長(zhǎng)或形態(tài)異常時(shí)，需優(yōu)先排查支原體污染可能。

表1. 支原體檢測(cè)方法對(duì)比

支原體的耐受溫度范圍在35-37℃，將污染的細(xì)胞置于41℃處理5-10 h（最長(zhǎng)不超過(guò)18 h），可以殺滅支原體。但不同的細(xì)胞對(duì)高溫的耐受程度不同，此方法可能損傷細(xì)胞，需要慎重使用。

支原體對(duì)部分抗生素（如卡那霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星等）具有一定的敏感性。將細(xì)胞培養(yǎng)在含抗生素的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，連續(xù)多次檢測(cè)支原體為陰性，即清除成功。但過(guò)度使用抗生素可能誘導(dǎo)耐藥或毒性反應(yīng)，需謹(jǐn)慎操作。

推薦使用復(fù)合型支原體清除試劑，其通常含有抗生素和支原體脂蛋白膜穿透劑，能破壞支原體的脂蛋白膜、干擾其代謝途徑、抑制DNA復(fù)制，從而達(dá)到清除支原體的目的。推薦產(chǎn)品：普諾賽Anti-Myc 支原體清除試劑（貨號(hào)：P-CMR-001）。按照說(shuō)明書(shū)將適量試劑加入細(xì)胞培養(yǎng)基孵育，即可清除支原體。該方法操作簡(jiǎn)便、效果-顯著，且對(duì)細(xì)胞的毒性相對(duì)較小，能較好地保持細(xì)胞的活性。

對(duì)清除支原體后的細(xì)胞，需通過(guò) qPCR、DNA熒光染色等方法進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)支原體是否已被完-全清除，避免試劑殘留或支原體復(fù)蘇導(dǎo)致假陰性結(jié)果。