帕金森?。≒D）的神經變性與外周免疫細胞（尤其是 T 細胞）浸潤中樞神經系統（CNS）及其與腦內細胞的相互作用密切相關，但 T 細胞與腦細胞的具體作用機制尚未明確。

構建一種由人誘導多能干細胞（hiPSC）衍生的中腦類器官（hMO）與外周血 T 細胞組成的 3D 共培養模型，旨在模擬 T 細胞與中腦組織的空間相互作用，為研究 PD 相關免疫 - 神經相互作用提供工具。

第一章：經典回顧

（一）人中腦類器官（hMO）的生成與分化：hMO 由健康供體成纖維細胞重編程為 hiPSC 后誘導分化而來

• hiPSC 制備

• 健康供體成纖維細胞通過逆轉錄病毒轉導 OCT3/4、c-MYC、SOX2、KLF4 四因子重編程為 hiPSC，篩選 TRA1-60 陽性率 > 95% 的細胞系。

• 分階段分化（30 天 / 60 天）

1. 神經誘導階段（第 0-4 天）

2. hiPSC 單細胞接種于低吸附 U 型 96 孔板，使用神經誘導培養基（DMEM/F12:Neurobasal=1:1，添加 N2、B27（無維生素 A）、GlutaMAX、非必需氨基酸、β- 巰基乙醇、肝素、10μM SB431542、200ng/ml Noggin、0.8μM CHIR99021），并加入 10μM ROCK 抑制劑 Y27632（前 48 小時），2 天更換一次培養基。

3. 中腦模式化階段（第 4-7 天）

4. 加入 100ng/ml SHH-C25II 和 100ng/ml FGF8，誘導神經外胚層芽形成。

5. 組織生長階段（第 7 天后）

6. 將類器官嵌入 20μL Matrigel，使用組織生長誘導培養基（含 Neurobasal、N2、B27、胰島素、層粘連蛋白、SHH-C25II、FGF8）培養 24 小時；隨后轉移至超低吸附 6 孔板，使用終分化培養基（含 BDNF、GDNF、抗壞血酸、db-cAMP），置于搖床上培養（促進營養交換），每 2 天換液，持續至 30 天或 60 天。

（二）外周血 T 細胞的分離與激活

分離：健康供體外周血單個核細胞（PBMC）中，通過 Pan T 細胞分離試劑盒（磁珠陰性選擇法）分離 T 細胞，培養于含 10% 熱滅活胎牛血清（FCS）的 RPMI 培養基中。

激活：使用 CD3/CD28 磁珠體外激活 T 細胞 48 小時（通過抗 CD3 和 CD28 抗體分別觸發 T 細胞受體和共刺激分子），激活后渦旋 1 分鐘去除磁珠，用于后續共培養。

（三）共培養實驗步驟（核心部分）

1. 共培養條件優化：通過測試 4 種培養基（hMOM、hMOM+IL-2、SFLM、SFLM+IL-2），評估 hMO 存活率和 T 細胞活性，確定最佳條件

• hMOM（中腦類器官培養基）

• 支持 hMO 存活的基礎培養基（含 Neurobasal、N2、B27、BDNF、GDNF 等）。

• IL-2 補充

• 25U/ml IL-2 可維持 T 細胞存活與激活（流式細胞術顯示 CD25 + 激活 T 細胞比例更高，存活率提升）。

• 最終選擇

• hMOM+IL-2 為共培養培養基（同時支持 hMO 存活和 T 細胞活性）。

2. 共培養操作流程

• 細胞準備

• hMO：選擇 30 天齡（1 個月）或 60 天齡（2 個月）的 hMO（分別模擬不同成熟階段）。

• T 細胞：使用激活后的 T 細胞（CD3+CD25 + 比例約 100%）。

• 接種比例

• 每孔 2 個 hMO 對應 100 萬 T 細胞（參考 PD 患者死后中腦組織中 T 細胞與神經細胞比例）。

• 培養條件

• 24 孔板中加入 2ml hMOM+IL-2 培養基，放入 hMO 和 T 細胞。

• 37°C、5% CO?培養箱中，置于搖床上培養 7 天（促進細胞接觸和營養交換），每 2 天更換一次培養基。

3. 共培養后分析方法

• T 細胞浸潤檢測

• 通過免疫細胞化學（ICC）染色 CD3 + 細胞，定量 hMO 中 T 細胞比例（流式細胞術或 ImageJ 計數）。

• 神經細胞損傷評估

• TUNEL 染色檢測細胞凋亡（定量 TUNEL + 細胞比例）。

• MAP2 免疫熒光染色（神經元標志物），通過平均熒光強度（MFI）評估神經元丟失。

• T 細胞表型分析

• 流式細胞術檢測浸潤 T 細胞的亞型（CD4+/CD8 + 比例）、細胞毒性分子（CD107a、顆粒酶 B）及細胞因子（IFN-γ、IL-17、TNF-α 等）。

（四）本文研究的主要結果

1. T 細胞浸潤與神經損傷

2. 激活的 T 細胞可浸潤 hMO，且 60 天齡 hMO 浸潤更多（年齡依賴性）；T 細胞浸潤導致 hMO 中 MAP2 + 神經元減少，TUNEL + 凋亡細胞增加（與 T 細胞比例呈正相關）。

3. 腦區特異性

4. 與大腦皮質類器官（hCO）相比，hMO 對 T 細胞浸潤更敏感，且 T 細胞介導的神經損傷更顯著（符合 PD 中中腦易損性特征）。

5. 機制提示

6. 浸潤的 T 細胞高表達 LFA-1 和 VLA-4 整合素（與 hMO 中的 ICAM-1、VCAM-1 配體結合），且 CD8+ T 細胞分泌顆粒酶 B 等細胞毒性分子，CD4+ T 細胞分泌促炎細胞因子，共同介導神經損傷。

上述3D 共培養模型可模擬 T 細胞與中腦組織的空間相互作用，揭示了 T 細胞浸潤的年齡依賴性（老年 hMO 更敏感）和腦區特異性（中腦比皮質更易受損），為研究 PD 中免疫介導的神經變性機制及潛在治療靶點提供了新工具。

第二章：用于T細胞和中腦類器官共培養的其他研究方法

除了第一章節文中提到的 3D 直接共培養方法（hMO 與 T 細胞在 hMOM+IL-2 培養基中混合培養），針對 T 細胞與中腦類器官的共培養研究，還有多種方法可從系統結構、細胞互作模式、環境模擬等角度優化或擴展

從微環境模擬（如Kirkstall Quasi Vivo微流控類器官串聯芯片、支架）、細胞互作模式（間接共培養、多細胞協同）、病理相關性（疾病特異性模型）和動態監測（實時成像）等角度擴展了共培養體系，可根據研究目標（如機制探索、藥物篩選）選擇適配的方法。例如，微流控模型適合研究 T 細胞遷移的分子機制，Kirkstall Quasi Vivo多細胞串聯共培養模型更適合解析免疫網絡對神經變性的調控。

一、微流控芯片共培養系統

原理與設計

利用微流控技術構建仿生微環境，通過微通道分隔或連接類器官與 T 細胞區域，精準控制細胞接觸方式、營養梯度和可溶性因子交換，模擬體內血流動力學和組織微環境。

操作要點

• 芯片結構

• 設計雙腔室或多通道芯片，一側接種中腦類器官（hMO），另一側接種 T 細胞，通過微米級通道連接（通道孔徑可調節，控制細胞遷移能力）。

• 流體控制

• 采用 syringe pump 維持培養基低速流動（如 1-5 μL/min），模擬腦內組織液循環，確保營養和代謝物交換，同時避免剪切力損傷細胞。

• 優勢

• 可實時觀察 T 細胞定向遷移（通過通道進入 hMO 區域）的動態過程；精準調控細胞因子（如趨化因子 CXCL12）的濃度梯度，研究其對 T 細胞浸潤的影響；避免傳統靜態培養中代謝物積累的問題，延長共培養時間（可至 2-4 周）。

二、間接共培養模型（非接觸式）

原理

通過物理屏障（如 Transwell 小室）分離 hMO 與 T 細胞，僅允許可溶性因子（細胞因子、趨化因子等）通過，研究 T 細胞通過 “旁分泌作用” 而非直接接觸對中腦組織的影響。

操作要點

• Transwell 設置

• 將 hMO 接種于下室（6 孔板），T 細胞接種于上室（0.4 μm 孔徑的 Transwell 插入式小室，允許小分子通過但阻止細胞遷移）。

• 培養基

• 使用文中優化的 hMOM+IL-2 培養基，確保上下室營養一致。

• 檢測指標

• 下室 hMO 的神經元存活（MAP2 表達）和凋亡（TUNEL）；上室 T 細胞分泌的細胞因子（如 IFN-γ、TNF-α）水平（通過 ELISA 或流式細胞術檢測）；對比直接共培養結果，區分 “T 細胞直接接觸損傷” 與 “細胞因子介導的間接損傷”。

三、多細胞共培養模型（引入腦內常駐細胞）

1. 加入小膠質細胞（腦內常駐免疫細胞）

原理

小膠質細胞是腦內免疫調節的核心細胞，可與 T 細胞相互作用（如呈遞抗原、分泌細胞因子），共同影響神經元存活。該模型更接近體內 “T 細胞 - 小膠質細胞 - 神經元” 的復雜互作網絡。

操作要點

• 小膠質細胞來源

• 從 hiPSC 誘導分化為小膠質細胞（通過添加 CSF1、IL-34 等因子），或使用原代小膠質細胞。

• 共培養步驟

1. 先將小膠質細胞與 hMO 共培養 3 天（讓其整合入類器官）；

2. 再加入激活的 T 細胞，使用 hMOM+IL-2 培養基，置于搖床上培養 7 天。

• 優勢

• 研究小膠質細胞是否通過 “吞噬 T 細胞釋放的顆粒酶” 或 “分泌抗炎因子（如 IL-10）” 調節神經損傷，解釋免疫細胞間的協同或拮抗作用。

2. 引入血管內皮細胞（模擬血腦屏障）

原理

血腦屏障（BBB）破壞是 T 細胞浸潤腦內的前提，通過在 hMO 表面構建內皮細胞層（模擬 BBB），研究 T 細胞如何突破屏障進入中腦組織。

操作要點

• BBB 模擬

• 在 hMO 表面接種人腦微血管內皮細胞（HBMEC），培養 5-7 天形成緊密連接（通過檢測 ZO-1、Claudin-5 等緊密連接蛋白驗證）。

• 共培養

• 將 T 細胞接種于內皮細胞層外側，觀察其是否通過 “破壞緊密連接” 或 “跨內皮遷移” 進入 hMO，通過電鏡或免疫熒光檢測內皮屏障完整性（如 permeability 實驗）。

四、3D 支架輔助共培養

原理

使用生物相容性支架（如明膠、海藻酸鈉水凝膠）為 hMO 和 T 細胞提供更接近體內的三維空間結構，促進細胞外基質（ECM）相互作用，增強類器官的成熟度和 T 細胞的浸潤效率。

操作要點

• 支架制備

• 將 hMO 嵌入含 ECM 成分（如層粘連蛋白、纖維連接蛋白）的水凝膠中，支架孔隙率控制在 100-200 μm（允許 T 細胞遷移）。

• 共培養

• 在支架周圍接種 T 細胞，使用 hMOM+IL-2 培養基，通過 confocal 顯微鏡觀察 T 細胞在支架內的遷移路徑及與 hMO 的空間接觸。

• 優勢

• 支架可調節硬度（模擬腦內不同區域的機械特性），研究力學信號對 T 細胞 - 神經元互作的影響（如中腦區域的軟硬度是否促進 T 細胞浸潤）。

五、疾病特異性共培養模型

原理

文中使用健康供體的 hMO 和 T 細胞，而疾病特異性模型可通過引入 PD 患者來源的細胞，更精準模擬病理狀態下的免疫 - 神經互作。

操作要點

• PD 患者 hMO

• 從 PD 患者皮膚成纖維細胞重編程為 hiPSC，誘導分化為 hMO（攜帶 PD 相關突變，如 LRRK2 G2019S），其多巴胺能神經元通常表現出 α- 突觸核蛋白聚集、線粒體功能異常等表型。

• PD 患者 T 細胞

• 分離 PD 患者外周血 T 細胞（可能存在異常激活表型，如 Th17 細胞比例升高）。

• 共培養

• 采用文中優化的 hMOM+IL-2 條件，對比患者與健康對照的 T 細胞浸潤能力、神經損傷程度，揭示 PD 特異性免疫機制。

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