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樣本質量對熒光定量檢測有哪些影響?

來源:北京佰司特科技有限責任公司   2025年07月31日 16:16  
樣本質量是熒光定量檢測(如qPCR、熒光定量免疫分析等)結果準確性的根基,其影響貫穿從核酸/蛋白提取到最終信號讀取的全流程,核心問題集中在干擾檢測體系、引入假陽性/假陰性或導致數據失真。具體影響及機制如下:
 
一、樣本采集與保存不當:破壞目標物質穩定性
 
樣本從采集到處理的每一步操作失誤,都會直接影響目標分析物(核酸、蛋白等)的完整性或濃度。
 
降解問題:
 
核酸樣本(如血液、組織)若未及時冷藏或添加穩定劑(如EDTA、RNA保存液),會因核酸酶(DNase、RNase)活性激活導致DNA/RNA斷裂,qPCR中可能因引物無法有效結合而出現擴增效率下降,Ct值偏大甚至無擴增。
 
蛋白樣本若反復凍融或高溫保存,會因變性聚集失去抗原性,導致熒光免疫檢測中抗體結合效率降低,信號強度偏低。
 
濃度偏差:
 
采集量不足(如血清量過少)或保存過程中蒸發,會導致目標物質濃度被高估(因溶劑減少);而溶血、脂血樣本(如紅細胞破裂釋放血紅蛋白)會稀釋目標物,造成濃度低估。
 
二、樣本基質干擾:抑制檢測反應或產生背景信號
 
樣本中除目標物外的其他成分(基質)可能通過物理或化學作用干擾檢測體系,尤其在未充分提純的樣本中更明顯。
 
PCR抑制劑:
 
血液中的血紅蛋白、膽紅素,土壤中的腐殖酸,植物樣本中的多酚類物質等,會通過螯合Mg²?(PCR酶輔因子)、吸附DNA聚合酶或直接破壞核酸結構,抑制擴增反應。例如,未純化的全血樣本直接擴增時,常出現Ct值延遲或擴增曲線異常(如平臺期提前)。
 
熒光淬滅或增強:
 
某些基質成分(如深色色素、高濃度鹽離子)會吸收或散射激發光,導致熒光信號被淬滅(信號偏低);而脂質顆粒可能非特異性結合熒光染料(如SYBRGreen),產生背景熒光(假陽性信號)。
 
非特異性結合:
 
在熒光免疫檢測中,樣本中的雜蛋白可能與抗體交叉反應,或吸附在檢測孔表面,導致背景信號升高,降低檢測特異性。
 
三、樣本前處理缺陷:引入誤差或污染
 
前處理(如提取、純化、稀釋)是樣本質量控制的關鍵環節,操作不當會放大誤差。
 
提取效率低:
 
核酸/蛋白提取時若裂解不充分(如組織未徹底勻漿),會導致目標物回收率低,測量值低于真實值;而離心不徹底殘留的雜質(如細胞碎片)會堵塞光路或干擾反應。
 
交叉污染:
 
處理多個樣本時,若移液器污染、耗材重復使用或環境中存在擴增產物氣溶膠,會導致樣本間交叉污染,出現假陽性結果(尤其是qPCR檢測低豐度目標時)。
 
稀釋誤差:
 
高濃度樣本需稀釋至檢測線性范圍內,若稀釋倍數計算錯誤或混合不均,會導致結果偏離真實值(如10倍稀釋操作失誤變為5倍,結果被高估1倍)。
 
四、樣本均一性差:導致重復檢測結果波動
 
樣本本身的物理不均一會使平行實驗間差異增大,尤其對固體或半固體樣本影響顯著。
 
組織樣本異質性:
 
腫瘤組織中癌細胞分布不均,若取樣位置不同,目標基因(如癌基因)的表達量可能差異顯著,導致重復檢測的Ct值標準差增大(通常要求平行樣Ct值差<0.5,否則結果不可靠)。
 
懸浮樣本沉淀:
 
細胞懸液、細菌培養液若未充分混勻,取樣時目標物濃度隨時間變化,會導致平行孔間信號差異超過允許范圍(如CV值>5%)。

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