一、實驗材料

1、樣本來源：人腦組織（通常來源于手術切除的皮質灰質區域，需符合倫理規范）。

2、試劑

PBS（含青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml）

膠原酶（1 mg/ml）和DNaseⅠ（10 μg/ml）混合消化液

250 g/L牛血清白蛋白（BSA）

基礎培養基（如DMEM或特制培養基）

3、耗材

眼科剪、鑷子

不同孔徑尼龍篩（60 μm、150 μm、230 μm）

離心管（15 ml、50 ml）

二、實驗步驟

1、組織處理

將人腦組織置于預冷的PBS中，去除腦膜及表面大血管，保留皮質灰質。

使用勻漿機將灰質組織制成勻漿，以釋放微血管片段。

2、酶消化

加入含膠原酶和DNaseⅠ的消化液，37℃消化1小時，隨后離心去除上清中的脂肪碎片和髓磷脂。

將沉淀重新懸浮于消化液中，繼續消化1-3小時以充分解離微血管。

3、分級過濾

消化產物依次通過230 μm和150 μm尼龍篩，去除大血管和碎片。

濾液通過60 μm尼龍篩，收集截留的微血管內皮細胞，并用培養基沖洗至培養皿中。

4、純化與培養

使用250 g/L BSA梯度離心（4000 rpm，10分鐘）進一步純化微血管內皮細胞。

將細胞重懸于含特制添加劑的培養基（如原代內皮細胞培養基），接種至多聚賴氨酸包被的培養板中，置于37℃、5% CO?培養箱中培養。

三、關鍵注意事項

樣本新鮮度：人腦組織需盡快處理（建議在2小時內），避免細胞活性下降。

污染控制：嚴格無菌操作，并在PBS中添加抗生素防止微生物污染。

酶消化優化：膠原酶濃度和消化時間需根據組織特性調整，過長可能導致細胞損傷。

純度驗證：可通過免疫熒光染色鑒定內皮細胞純度。

四、與動物模型方法的差異

組織處理：人腦組織通常更致密，需更長時間消化（動物模型多采用30-45分鐘）。

篩網選擇：動物模型多用離心法分層，而人源細胞依賴分級過濾。

培養基：人源細胞常需添加特制生長因子，而大鼠BMEC可用DMEM基礎培養基。

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