在細胞研究領域，永生化人牙齦成纖維細胞 - hTERT 是一種具有價值的實驗模型。通過引入 hTERT 基因，這些細胞能夠突破細胞衰老的限制，實現無限增殖，同時保留了牙齦成纖維細胞的正常表型和功能。這使得它們在細胞生物學、組織工程、藥物篩選等多個研究方向上有著廣泛的應用。接下來，將從技術參數的角度深入解析這一細胞系的特點與應用。

一、細胞增殖活性檢測

（一）MTT 法原理與優化

MTT 法是一種常用的細胞增殖活性檢測方法。其原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可將 MTT 還原為不溶性的藍紫色結晶 formazan，而死細胞因缺乏這種酶活性無法進行還原反應。通過測定 formazan 在特定波長（570nm）的吸光度值，可間接反映細胞增殖情況。在研究永生化人牙齦成纖維細胞 - hTERT 時，優化實驗條件至關重要。例如，細胞接種密度應控制在 5×103 - 1×10? cells/well，以確保細胞在實驗期間處于對數生長期。同時，MTT 試劑的濃度和孵育時間也需優化，一般 MTT 試劑濃度為 0.5mg/mL，孵育時間為 4 - 6 小時。

（二）CCK - 8 法的優勢與應用

CCK - 8 法與 MTT 法類似，但其底物 WST - 8 在活細胞線粒體中被還原為水溶性的 formazan 染料，無需進行細胞溶解步驟，操作更為簡便。其優勢在于靈敏度高，尤其適用于低濃度細胞增殖檢測。在研究細胞對不同藥物的響應時，CCK - 8 法可快速、準確地評估細胞增殖活性變化。例如，在篩選促進牙齦組織修復的藥物時，通過 CCK - 8 法檢測細胞增殖情況，可快速篩選出潛在的有效藥物。

二、細胞周期分析

（一）流式細胞術原理與操作

流式細胞術是一種基于細胞 DNA 含量變化來分析細胞周期分布的技術。通過將細胞固定、滲透處理后，加入 DNA 染料（如 PI 或 7 - ADD），染料可嵌入 DNA 雙螺旋結構中，其熒光強度與 DNA 含量成正比。利用流式細胞儀檢測每個細胞的熒光信號，經軟件分析可得到細胞在 G0/G1、S、G2/M 期的比例分布。在操作過程中，細胞固定是關鍵步驟之一。常用 70% 乙醇在 - 20℃下固定細胞，固定時間不少于 4 小時，但不宜超過 7 天，以免 DNA 降解影響檢測結果。

（二）細胞周期檢測的應用場景

在研究細胞周期調控機制時，細胞周期分析是很需要的工具。例如，在探討不同生長因子對永生化人牙齦成纖維細胞 - hTERT 增殖的影響時，通過流式細胞術分析細胞周期分布，可了解生長因子如何影響細胞周期進程。若某一生長因子使細胞在 S 期的比例顯著增加，表明該因子可能促進了細胞 DNA 合成，進而促進細胞增殖。

三、細胞凋亡檢測

（一）Annexin V - FITC/PI 雙染法原理

Annexin V - FITC/PI 雙染法是檢測早期凋亡細胞的常用方法。Annexin V 可特異性結合細胞膜磷脂酰絲氨酸（PS），而 PS 在正常細胞中位于膜內側，細胞凋亡早期會外翻至膜外側。FITC（異硫氰酸熒光素）標記的 Annexin V 可標記早期凋亡細胞；PI（碘化丙啶）則無法穿透完整細胞膜，僅對晚期凋亡或壞死細胞的核進行染色。通過流式細胞儀檢測，可區分活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞。在實驗中，細胞染色后應盡快上機檢測，一般在 1 小時內完成檢測，以避免細胞凋亡進程的進一步發展影響檢測結果。

（二）TUNEL 法的應用場景

TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase - mediated dUTP nick end labeling）法是一種檢測 DNA 斷裂的細胞凋亡原位檢測方法。其原理是細胞凋亡時，DNA 雙鏈斷裂產生 3' - OH 末端，TUNEL 反應體系中的末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）可將生物素或熒光素標記的 dUTP 連接到這些末端，經熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測可定位凋亡細胞。TUNEL 法適用于研究細胞在受到物理、化學損傷后的凋亡情況，尤其在細胞貼壁培養狀態下，可直觀觀察細胞形態與凋亡信號的關系。例如，在研究藥物對細胞的毒性作用時，TUNEL 法可直觀顯示細胞凋亡的形態學變化。

四、細胞表型與功能分析

（一）細胞表型標志物檢測

免疫熒光染色法

免疫熒光染色法利用熒光標記的抗體特異性識別細胞內的蛋白質抗原，通過熒光顯微鏡觀察其表達和定位。對于永生化人牙齦成纖維細胞 - hTERT，常用標志物包括波形蛋白（Vimentin）、纖維連接蛋白（Fibronectin）等。例如，波形蛋白是中間絲蛋白，在成纖維細胞中高度表達。通過免疫熒光染色可直觀觀察其在細胞內的分布情況，評估細胞的成纖維細胞表型維持程度。在實驗操作中，需注意抗體的選擇與驗證，確保其特異性和靈敏度符合要求。

Western blot 分析

Western blot 是一種用于檢測蛋白質表達水平的經典方法。通過 SDS - PAGE 電泳分離蛋白質，轉膜后用特異性抗體進行雜交，顯色后可通過凝膠成像系統定量分析目標蛋白的表達量。對于永生化人牙齦成纖維細胞 - hTERT，Western blot 可精確檢測表型相關蛋白的表達變化。例如，在研究細胞在不同培養條件下的表型穩定性時，通過 Western blot 檢測波形蛋白、纖維連接蛋白的表達量，可深入探究培養條件對細胞表型的影響。

（二）細胞外基質合成與降解分析

糖胺聚糖（GAG）含量測定

糖胺聚糖是細胞外基質的重要組成部分，其含量可反映細胞的合成代謝活性。常用的方法是 Blyscan 硫酸糖胺聚糖比色測定試劑盒，其原理是利用 1,9 - 二甲基亞甲基藍與硫酸糖胺聚糖特異性結合，產生藍色復合物，在 656nm 波長處有特征吸收峰。通過測定吸光度值并與標準曲線對比，可定量分析細胞培養上清或組織勻漿中 GAG 含量。在研究細胞對不同刺激的響應時，GAG 含量測定可評估細胞的基質合成能力。例如，在研究生長因子對細胞外基質合成的促進作用時，通過 GAG 含量測定可量化評估其效果。

基質金屬蛋白酶（MMPs）活性檢測

基質金屬蛋白酶是一類能夠降解細胞外基質的酶，在組織重塑和疾病過程中發揮重要作用。采用明膠酶譜法（Zymography）可檢測 MMPs 活性。將細胞培養上清與含有明膠的 SDS - PAGE 凝膠進行電泳，MMPs 在凝膠中水解明膠形成透明帶，通過凝膠成像系統分析透明帶位置和大小，可初步判斷 MMPs 的類型和活性。若需精確測定 MMPs 活性，可使用熒光標記的底物法，根據熒光強度變化計算酶活性單位。在研究細胞在炎癥環境下的基質降解情況時，MMPs 活性檢測可揭示細胞外基質降解機制。

五、細胞信號通路分析

（一）hTERT 信號通路關鍵蛋白檢測

免疫共沉淀技術

免疫共沉淀技術可用于檢測 hTERT 信號通路中蛋白質之間的相互作用。例如，研究 hTERT 與細胞周期相關蛋白（如 p16、p53）的結合情況時，先用抗 p53 抗體孵育細胞裂解液，使 p53 蛋白與抗體結合形成免疫復合物，通過蛋白 A/G 瓊脂糖凝膠捕獲復合物，經洗滌后用抗 hTERT 抗體進行 Western blot 檢測，驗證兩者相互作用。在實驗過程中，需優化抗體濃度、孵育時間和洗滌條件，以提高免疫共沉淀的特異性和效率。

酶聯免疫吸附測定（ELISA）

Ras 活性檢測 ELISA 試劑盒是一種快速、簡便的檢測方法。其原理是利用 hTERT 蛋白與下游效應分子的特異性結合，將生物素標記的效應分子固定在微孔板上，加入細胞裂解液后，活化的 hTERT 蛋白與之結合，再通過抗 hTERT 抗體和酶標記二抗進行顯色反應，吸光度值與活化 hTERT 蛋白量成正比。該方法適用于高通量篩選實驗，可快速評估不同處理條件下 hTERT 信號通路的激活狀態。

（二）下游信號通路磷酸化水平分析

Western blot 檢測磷酸化蛋白

Western blot 是分析信號通路磷酸化水平的常用方法。以 MAPK 信號通路為例，使用特異性抗磷酸化 ERK1/2 抗體，可檢測 ERK1/2 蛋白的磷酸化水平，反映信號通路的激活程度。在實驗中，需使用磷酸酶抑制劑處理細胞裂解液，防止磷酸化蛋白在提取過程中去磷酸化。同時，應設置總蛋白抗體作為內參，校正蛋白加載量差異，確保檢測結果的準確性。

流式細胞術檢測細胞內磷酸化蛋白

流式細胞術也可用于檢測細胞內磷酸化蛋白水平。通過固定、透化細胞后，用熒光標記的抗磷酸化蛋白抗體進行染色，利用流式細胞儀檢測細胞內熒光信號強度。該方法的優勢在于可同時檢測細胞表面標志物和內源性磷酸化蛋白，實現細胞分群和信號通路分析的結合。例如，在研究不同細胞亞群對藥物刺激的響應時，流式細胞術可提供細胞群體水平的信號通路激活信息。