一、背景

人膜間皮細(xì)胞是用pRSV-T質(zhì)粒(含有SV40早期區(qū)域和勞斯肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列的SV40 ori構(gòu)建體)轉(zhuǎn)染細(xì)胞并克隆。間皮細(xì)胞從非癌個(gè)體獲得的胸膜液中分離。

二、人膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程

1、人膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備Medium 199培養(yǎng)基(添加NaHCO3 1.5g/L,3.3 nM EGF，400 nM氫化可的松，870 nM牛胰島素，20 mM HEPES，3.87µg/L H2SeO3)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。

2）人膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）人膜間皮細(xì)胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。

2、人膜間皮細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇人膜間皮細(xì)胞：將含有1mL人膜間皮細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有人膜間皮細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查人膜間皮細(xì)胞密度。

2）人膜間皮細(xì)胞傳代：如果人膜間皮細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁人膜間皮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗人膜間皮細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若人膜間皮細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3ml此細(xì)胞的培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.移入到事先準(zhǔn)備好的含有5ml培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中或含有14ml培養(yǎng)基的T-75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

3）人膜間皮細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，先要消化處理并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。消化方法按照細(xì)胞傳代方法的1-3步驟進(jìn)行，最后的重懸液使用血清。懸浮人膜間皮細(xì)胞直接計(jì)數(shù)后離心，用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中。

三、應(yīng)用

人膜間皮細(xì)胞可以用于苦參堿抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化機(jī)制的研究：

通過(guò)探索苦參堿對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞EMT的影響,為防治腹膜纖維化藥物的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

方法：采用5ng/ml的TGF-β1誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞使其發(fā)生EMT,同時(shí)給予不同濃度的苦參堿(0.4、0.6、0.8和1.0mg/ml)進(jìn)行干預(yù)處理,然后分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫蛋白印跡(western blotting,WB)檢測(cè)EMT相關(guān)基因(E-cadherin、α-SMA、ColⅢ和Fibronectin)的mRNA和蛋白的表達(dá)水平,根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和WB結(jié)果分析苦參堿對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞EMT是否存在抑制作用。

如果苦參堿對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞EMT存在顯著的抑制作用,則選取苦參堿抑制人腹膜間皮細(xì)胞EMT的濃度,然后再使用5ng/ml的TGF-β1誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞使其發(fā)生EMT,同時(shí)采用濃度的苦參堿干預(yù)處理人腹膜間皮細(xì)胞,收集細(xì)胞提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RNA-seq測(cè)序分析其全基因組的mRNA的表達(dá)水平并篩選表達(dá)差異顯著的基因,再利用這些基因進(jìn)行KEGG Pathway分析其主要富集的信號(hào)通路,初步探索苦參堿抑制人腹膜間皮細(xì)胞EMT的具體分子機(jī)制,最后通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和WB進(jìn)行驗(yàn)證。

結(jié)果：(1)5ng/ml的TGF-β1刺激能上調(diào)人腹膜間皮細(xì)胞α-SMA、ColⅢ和Fibronectin的mRNA和蛋白表達(dá)水平,下調(diào)E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平;不同濃度的苦參堿(0.4、0.6、0.8和1.0mg/ml)干預(yù)處理后均能下調(diào)α-SMA、ColⅢ和Fibronectin的mRNA和蛋白表達(dá)水平,上調(diào)E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平,其中0.8和1.0 mg/ml的苦參堿的干預(yù)。

(2)RNA-seq測(cè)序的結(jié)果顯示,以q Value<0.05且差異倍數(shù)|Fold Change|>2為篩選條件,韋恩圖取各處理組表達(dá)差異顯著的基因之間的交集,篩選獲得154個(gè)表達(dá)差異顯著的基因與苦參堿抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞EMT相關(guān);進(jìn)一步通過(guò)KEGG通路分析這154個(gè)基因發(fā)現(xiàn)其主要富集在MAPK等信號(hào)通路上;另外,在這154個(gè)表達(dá)差異顯著的基因中發(fā)現(xiàn)TGF-β1激活的Smad依賴和非Smad依賴信號(hào)通路的共同下游因子Snail2表達(dá)差異顯著。

(3)WB檢測(cè)MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白ERK1/2的磷酸化水平,結(jié)果顯示TGF-β1能顯著上調(diào)ERK1/2磷酸化蛋白的表達(dá)水平,而苦參堿干預(yù)處理后能使其水平下調(diào)。結(jié)論:苦參堿通過(guò)ERK1/2 MAPK信號(hào)通路下調(diào)Snail2基因的表達(dá)水平來(lái)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞EMT。

北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司的微生物菌種查詢網(wǎng)提供微生物菌種保藏、測(cè)序、購(gòu)買等服務(wù),是中國(guó)微生物菌種保藏中心的服務(wù)平臺(tái)，并且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢類網(wǎng)站，自設(shè)設(shè)備及技術(shù)的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶來(lái)詢！