動物模型，是醫學研究者精心構建的模擬人類疾病表現的生命載體，其精準復刻了疾病的復雜進程與關鍵特征。主要用于實驗生理學、實驗病理學和實驗治療學（包括新藥篩選）研究。比如一些經典的動物模型———EAE模型、糖尿病模型、腸炎模型、帕金森模型、AD模型等。

實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是 MS 最常見的動物模型，具有許多臨床和病理生理學特征。EAE模型多種多樣，反映了人類 MS 的不同臨床、免疫學和組織學特征。通過主動誘導的 EAE 小鼠模型是最容易誘導且結果穩健、可復制的模型。它特別適合使用轉基因小鼠研究藥物或特定基因對自身免疫性神經炎癥的影響。因此，小鼠通過皮下注射中樞神經系統勻漿或髓鞘蛋白肽進行免疫。

由于這些肽的免疫原性較低，因此使用了強效佐劑。EAE 的易感性和表型取決于所選抗原和嚙齒動物品系。C57BL/6 小鼠是轉基因小鼠構建中較常用的品系，且對髓鞘少突膠質細胞糖蛋白（MOG）有反應。將免疫原性表位 MOG35-55 懸浮在wan全弗氏佐劑（CFA）中進行免疫，并在免疫當天及兩天后注射百日咳毒素。小鼠在免疫后 9-14 天內出現“經典”自限性單相 EAE，表現為上升性弛緩性癱瘓。小鼠每天使用臨床評分系統進行評估，持續 25-50 天。

EAE模型誘導的成功率受多種因素的影響，包括小鼠的種類和性別、百日咳毒素的劑量、佐劑的使用、乳化程度以及豐富的實驗基礎和建模經驗。今天小愛著重為大家講解EAE造模過程中需要注意的細節。

一、EAE造模方法

1、實驗動物：6-8周齡的雌性C57BL/6小鼠

2、動物適應：將動物在實驗環境中適應1周，保持溫度、濕度和光照條件穩定，并使它們能夠自由獲取食物和水。

3、EAE模型建立

（1）MOG(35-55)溶液配制：將 MOG(35-55)（abs815889）多肽粉末充分溶解于預冷（4℃）無菌 PBS，終濃度為2.0 mg/mL。
注意：多肽溶解后常溫下易變性，長時間儲存容易失效，并且會有凍融穩定性風險，建議現配現用。

（2）CFA溶液配制：將熱滅活結核桿菌 H37 Ra 懸浮于CFA（abs9270）或弗氏不wan全佐劑（abs9271）中，并通過充分攪拌，熱滅活結核桿菌的終濃度達到 8.0 mg/mL。
警告：熱滅活的結核分枝桿菌刺激先天免疫反應，避免吸入、攝入以及與皮膚和眼睛接觸。制備佐劑時嚴格避免針刺傷，因為它可能導致肉芽腫或誘發自身免疫反應。

※熱滅活的結核分枝桿菌的作用及使用濃度

① 增強免疫原性

提供“危險信號”：結核桿菌的細胞壁成分（如分枝桿菌酸、脂阿拉伯甘露聚糖等）可通過Toll樣受體（TLR2/4）激活固有免疫系統，促進抗原提呈細胞（APC）的成熟和炎癥因子（如IL-12、TNF-α）的釋放，從而增強對MOG35-55的免疫應答。
誘導Th1/Th17極化：結核桿菌成分可驅動CD4+ T細胞向促炎的Th1（分泌IFN-γ）和Th17（分泌IL-17）亞群分化，這是EAE發病的核心機制。

② 形成肉芽腫反應

結核桿菌的持續刺激可導致注射部位形成肉芽腫，延長抗原釋放時間，維持慢性炎癥狀態。

③ 終濃度范圍：4–10 mg/mL，過高濃度（>10mg/mL）可能導致過度炎癥或動物死亡。

④ 愛必信的CFA（abs9270）每毫升含 1mg 熱滅活的干燥結核分枝桿菌 (H37Ra, ATCC 25177)。

（3）抗原乳液制備：按照 1:1 體積比將MOG(35-55)多肽溶液和 CFA 溶液加入兩支 10mL 玻璃注射器中，并通過三通連接兩支注射器。在冰上反復推注40min-2h，將抗原乳化至油包水狀態，MOG(35-55)多肽濃度達到 1.0mg/mL。

注意：①肽段的純度必須>98%；

②在制作乳液的過程中，損失量是很大的（一般損失1/3—1/2）。理論上一只小鼠需注射MOG肽200ug，十只鼠2mg，但加上損失量，免疫十只鼠需稱取4mg，以防損失后不夠用。乳液剩余，可放入4度冰箱，一星期之內使用沒問題；

③乳液制備不能使用塑料注射器，避免有機溶劑干擾，防止蛋白質吸附；

④乳劑可在免疫前儲存數天。制備乳劑后至少等待30分鐘以觀察其是否穩定，溶液應呈白色、粘稠且無相分離。免疫前，將溶液抽入兩個注射器中的一個，并連接針頭。

（4）PTX 溶液的制備：將50μg百日咳毒素（abs42024900）在500μL ddH2O（雙蒸水）中復溶，得到100 μg/mL的儲備液，儲存于4 °C。取 PTX儲備液加入無菌 PBS（abs962） 中稀釋，終濃度達到 3.0 ng/μL；
警告： 百日咳毒素具有多種生物學效應。避免吸入、攝入以及與皮膚和眼睛接觸。

（5）麻醉小鼠：使用異氟烷麻醉小鼠；

（6）EAE 模型：首先對麻醉后小鼠剃毛，在背部皮下、腋窩和腹股溝各皮下注射 50.0 μL 由 CFA 乳化的MOG(35-55)多肽溶液（確保皮下形成一個球狀腫塊，該腫塊應在整個實驗過程中持續存在）。在MOG(35-55)多肽乳液注射當天和 48 h 后，通過腹腔注射300ng/只的 PTX以增強疾病誘導（在小鼠尾根部進行顏色標記，確?？梢暂p松識別個體小鼠以進行每日評估）。

二、EAE模型監測

（1）臨床評分及體重監測

應每日評估體重和臨床評分。EAE的發作通常與體重減輕相關，每日監測并記錄 EAE 小鼠臨床表現及體重變化。

① 標準化評分系統0-5分量表（較常用）：從第0天開始，連續觀察30天或更長時間。 評分標準：0分：無癥狀。1分：尾部無力或癱瘓。2分：后肢無力。3分：后肢癱瘓。4分：四肢癱瘓。5分：死亡。

② 體重監測：EAE小鼠通常伴隨體重下降（>10%提示模型成功），需每日記錄，體重持續下降可能需倫理干預。

注意：當小鼠出現 EAE 臨床癥狀時，重要的是確保水瓶仍然可以被觸及，并將食物放在籠子地板上。

圖1 具有EAE癥狀的免疫小鼠圖片

圖2 典型疾病進程(n=6)

（2）行為學檢測

① 運動功能評估

轉棒實驗（Rotarod）：加速模式（4-40 rpm，5min內完成）記錄跌落時間，反映協調性與耐力。

步態分析（CatWalk或足印法）：量化步幅長度、基寬、擺動速度。

② 抑郁樣行為檢測

強迫游泳實驗（FST）：記錄不動時間（反映絕望行為）。

懸尾實驗（TST）：輔助驗證抑郁表型。

（3）組織病理學驗證

① 取材與處理

灌注固定：4%多聚甲醛灌注后取脊髓（腰膨大段）和腦組織。

切片制備：石蠟切片（5μm）或冷凍切片（10μm）。

② 染色方法

（4）分子生物學驗證

① 流式細胞術

細胞亞群分析：Th1（CD4+IFN-γ+）、Th17（CD4+IL-17+）、Treg（CD4+FoxP3+）。

樣本來源：脾臟、淋巴結、中樞神經系統單細胞懸液。

② 細胞因子檢測

ELISA/液相芯片：促炎因子：TNF-α、IL-6、IL-17

抗炎因子：IL-10、TGF-β

qPCR：脊髓/腦組織中細胞因子mRNA表達。

③ 蛋白表達分析

Western Blot：

炎癥通路蛋白：NF-κB p65、pSTAT3

神經保護標志物：BDNF、NGF

三、模型成功標準

基礎標準：發病率>80%（臨床評分≥2）；病理確認HE顯示炎性浸潤+ LFB證實髓鞘脫失。

高級標準：行為學異常（Rotarod時間↓50%）；分子標志物：Th17比例↑2倍，CNS中IL-17水平顯著升高。

四、EAE造模無癥狀原因分析

五、EAE動物模型特色應用案例

1. PTX構建C57BL/6小鼠EAE模型，成功揭示了SPAK信號通過調控脈絡叢屏障驅動MS病理的核心作用，并為SPAK-NKCC1抑制劑（如ZT-1a、布美他尼）治療MS提供了臨床前證據。

引用文獻：J Neuroinflammation. 2025 Mar 13;22:80. IF:9.3

2. PTX構建SD大鼠EAE 模型，研究Roflumilast在調節神經炎癥，改善多發性硬化癥(MS)運動功能和抑郁癥狀中的作用。

引用文獻：J Affect Disord. 2024 Apr 1:350:761-773. IF:6.6

參考文獻:

[1] Qi C, Wang Y, Li X, et al. Target inhibition of SPAK in choroid plexus attenuates T cell infiltration and demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 2025;22(1):80.

[2] Wang Z, Zhang Y, Chai J, et al. Roflumilast: Modulating neuroinflammation and improving motor function and depressive symptoms in multiple sclerosis. J Affect Disord. 2024;350:761-773.

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