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Wetern Blot蛋白印跡實(shí)驗(yàn)方法及步驟
主要是通過(guò)SDS凝膠分離、轉(zhuǎn)印到膜上并進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)的方法。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：
一、試劑和緩沖液
l 1x RIPA 緩沖液：50 mM Tris、 150 mM NaCl 、0.1% SDS、0.5% 脫氧膽酸鈉、 1% Triton X-100 或 NP40。
l 1x PBS 緩沖液：137 mM NaCl、2.7 mM KCl 、2.7 mM Na 2 HPO 4、2.7 mM KH 2 PO 4、 pH 7.4
l BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒或 Bradford 蛋白檢測(cè)試劑盒
l 1.5 M Tris 緩沖液 (pH 8.8)： 90.68 g Tris-HCl 至 ddH 2 O，使用 HCl 將 pH 調(diào)節(jié)至 8.8，最后 500 ml
l 1.0 M Tris 緩沖液 (pH 6.8)：60.58 g Tris-HCl 至 ddH 2 O，使用 HCl 將 pH 調(diào)節(jié)至 6.8，最后 500 ml
l 10% APS：使用前制備的 1 ml ddH 2 O中的 100 mg AP 。
l 10% SDS：10 g SDS 在 100 ml ddH 2 O 中。
l 1x Tris-甘氨酸緩沖液：Tris配比25 mM； PH=8.3 的甘氨酸配比230 mM、 SDS配比0.1% 。
l 3x SDS 蛋白上樣緩沖液配制：使用PH=6.8 的 Tris 150 mM 、SDS添加6% 、甘油 添加30% 、 EDTA濃度30 mM 和 溴酚藍(lán) 配比0.2% 。緩沖液應(yīng)隨用隨配、分裝冷凍備用。1x TTBS ： 25 mM Tris（pH 7.5）：0.15 M NaCl 、 0.05% Tween-20、0.001% 硫柳汞
l 1x 轉(zhuǎn)移緩沖液：3 g Tris、14.4 g 甘氨酸和 200 ml 甲醇，添加 ddH 2 O 至 1L
二、樣品制備
樣品也可以在一些商業(yè)裂解緩沖液中裂解，例如Thermo Fisher的 Pierce IP 裂解緩沖液 ，而不是 RIPA 緩沖液。
三、細(xì)胞培養(yǎng)樣品制備
1. 貼壁細(xì)胞
l 去除上清液并用 1X PBS 洗滌以去除殘留培養(yǎng)基。
l 添加預(yù)冷的 400 ul-1 ml 1X RIPA 緩沖液/100 mm 培養(yǎng)皿。在冰上孵育 5-10 分鐘。
l 刮去細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷的 1.5 ml 微管中。
l （可選）均質(zhì)化或超聲處理。
l 4°C 12,000 rpm 離心 10-15 分鐘，收集上清液備用。
l 總蛋白應(yīng)儲(chǔ)存在 -20°C 直至需要。
l （可選）取出 100 ul 等分試樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
l 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 1.5 ml 微管或 15 ml 試管中，并在 4°C 下以 2000 rpm 的速度離心 5 分鐘。
l 取出培養(yǎng)基，用 1 ml 預(yù)冷的 1x PBS 重懸沉淀，然后轉(zhuǎn)移到 1.5 ml 微管中。
l 在 4°C 下以 2000 rpm 離心 5 分鐘。
l 用 1 ml 預(yù)冷 RIPA 緩沖液/10 7 個(gè)細(xì)胞重懸細(xì)胞沉淀
l 將細(xì)胞懸液在冰上搖晃 30 分鐘。或均質(zhì)化/超聲處理。
l 4°C 12000 rpm 離心 10-15 分鐘，收集上清液備用。
l 總蛋白應(yīng)儲(chǔ)存在 -20°C 直至需要。
l 組織制備和定量。把它們切成小塊。
l 添加約 500-600 ul 預(yù)冷的 1x RIPA 緩沖液/100 mg 組織。
l 均勻組織。
l 在 4°C 下以 12000 rpm 離心 15-20 分鐘。
l 收集上清液備用。
l 總蛋白應(yīng)儲(chǔ)存在 -20°C 直至需要。
| 分離凝膠濃度（%） | 蛋白質(zhì)大小范圍 (kDa) |
| 8 | 25-200 |
| 10 | 15-100 |
| 12.5 | 10-70 |
| 15 | 12-45 |
| 20 | 4-40 |
四、蛋白質(zhì)定量
蛋白印跡實(shí)驗(yàn)步驟中的蛋白定量主要采用Bradford 法和 BCA 法。
1. SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠制備：6%-15% 分離凝膠由頂部的濃縮凝膠 (5%) 和凝膠梳（10 或 15 個(gè)孔）制成。
| 溶解凝膠（10ml） | 濃縮凝膠（3ml） | |||||
| 6% | 8% | 10% | 12% | 15% | ||
| H 2 0 | 5.3 | 4.6 | 4.0 | 3.3 | 2.3 | 2.1 |
| 30% 丙烯酰胺混合物* | 2.0 | 2.7 | 3.3 | 4.0 | 5.0 | 0.5 |
| 1.5M Tris（pH 8.8） | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 1.0M Tris (pH 6.8) 0.38 |
| 10% SDS | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.03 |
| 10% APS | 0.1 | 0.1 | 0.1 | .1 | 0.1 | 0.03 |
| TEMED | 0.008 | 0.006 | 0.004 | 0.004 | 0.004 | 0.003 |
l 將 2X SDS 蛋白質(zhì)上樣緩沖液與蛋白質(zhì)樣品以 1:1 的比例混合。樣品預(yù)熱到 50-60°C。進(jìn)行預(yù)染。
六、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移
將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 PVDF 或 NC 膜上進(jìn)行抗體檢測(cè)。
l 在 1X 轉(zhuǎn)印緩沖液中預(yù)潤(rùn)濕凝膠、Whatman 紙和海綿等材料。
l PVDF 膜應(yīng)在甲醇中孵育 10 秒。至 1 分鐘，然后移至 1X 轉(zhuǎn)移緩沖液。
l 將以下材料堆疊：外殼（黑色面）、海綿、Whatman 紙、凝膠、膜、Whatman 紙、海綿、外殼（透明面）。
l 將黑色面朝黑色放入轉(zhuǎn)印設(shè)備中。
l 在低溫環(huán)境中，使用轉(zhuǎn)印緩沖液進(jìn)行轉(zhuǎn)印操作。轉(zhuǎn)印電流和時(shí)間可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程和使用說(shuō)明進(jìn)行優(yōu)化。
七、抗體孵育
l 一抗在 1X TBST+3% BSA 中以推薦的稀釋度稀釋或根據(jù)結(jié)果優(yōu)化稀釋度。
l 在 4°C 下孵育過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間，或在室溫下孵育 4 小時(shí)。
l 回收一抗并儲(chǔ)存在 4°C。然后在 RT 的振動(dòng)篩上洗滌膜 3X 5-10 分鐘。
l 在 1X TBST 中稀釋二抗并將膜在室溫下孵育 1 小時(shí)或在振蕩器上在 4°C 下孵育 2-4 小時(shí)。
l 在 RT 的搖床上用 TBST 洗滌 3X 10 分鐘。
ECL+ 系統(tǒng)和 X 射線膠片用于 HRP 標(biāo)記的二抗。
蘇州阿爾法生物所提供的天能系列SDS-PAGE 、蛋白電泳預(yù)制膠、梯度預(yù)制膠、電泳儀、電泳槽、核酸電泳預(yù)制膠、核酸電泳儀、電泳儀電源、電泳槽等實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。
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