普通的Taq DNA 聚合酶的最適溫度是72℃，此時酶的活性最佳，低于此溫度，酶有較弱活性。在PCR擴增的升溫過程中，酶發(fā)揮較弱的活性，體系極易錯配或形成引物二聚體，尤其是當(dāng)設(shè)計的引物3’端是G 或C，錯配的鏈很難重新解開。非特異性擴增正是由于DNA聚合酶低溫下具有活性而引起的錯誤引導(dǎo)靶標(biāo)延伸和引物二聚體形成的。

非特異性擴增的具體影響包括：

• 目標(biāo)擴增子產(chǎn)量低；

• 目標(biāo)擴增子的靈敏度下降；

• 下游應(yīng)用效果不佳。

因此，要提高PCR 擴增的特異性和降低反應(yīng)錯配率，可以人為的控制酶的活性，在72℃之前讓酶不發(fā)揮活性，這樣就避免了在升溫（或配置反應(yīng)體系）過程中發(fā)生鏈的錯配，從而保證擴增的特異性。

而目前常用的提高PCR特異性的方法是使用熱啟動型Taq DNA聚合酶進行擴增，即熱啟動PCR。

熱啟動PCR，主要利用酶的修飾物在常溫下抑制DNA聚合酶的活性，加熱到變性溫度時修飾物失活，酶活得以釋放，從而使PCR反應(yīng)正常進行。

熱啟動PCR的優(yōu)勢：

• 阻止引物與低同源性的模板序列結(jié)合；

• 在PCR反應(yīng)開始之前，防止引物與引物之間形成引物二聚體；

• 提高目的片段的擴增靈敏度和產(chǎn)量；

• 可在室溫下配制反應(yīng)體系和設(shè)置反應(yīng)程序，使操作更為便利，且不會影響擴增性能和特異性。

熱啟動Taq DNA 聚合酶常用的修飾方法有化學(xué)修飾法、抗體法和配體修飾法等。其中化學(xué)修飾法和抗體法最為常用。雖然它們都能抑制室溫下的聚合酶活性，但兩者之間存在一些差異。

但是，酶激活時間較長可能會影響酶的活性，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量降低。

檸康酸酐與酶結(jié)合的原理

一般認(rèn)為Taq DNA聚合酶上賴氨酸基團有42個左右，但是由于空間結(jié)構(gòu)限制，其中一部分賴氨酸基團在基團內(nèi)部，無法與化學(xué)修飾基團相結(jié)合。

但其缺點是抗原抗體結(jié)合是一種動態(tài)平衡，試劑配比優(yōu)化時間長。

抗體與DNA聚合酶特異性結(jié)合封閉原理示意圖

兩種熱啟動修飾方法的比較

熱啟動PCR目前的應(yīng)用已是非常廣泛，在較難擴增的PCR反應(yīng)如基因組DNA、單拷貝序列的擴增、多重PCR和超長片段的擴增中的應(yīng)用尤為突出。

優(yōu)質(zhì)的熱啟動Taq DNA聚合酶，能有效降低或消除非特異性產(chǎn)物以及引物二聚體的形成，提高引物與模板結(jié)合的效率。

GenStar相關(guān)產(chǎn)品：

主要參考資料:

Saiki RK，Scbarf S，F(xiàn)aloona F，el a1．Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site anaylisis for diagnosis of sickle cell anemia[J]．Science，1985，230(4732)：1350-1354.

W ang Y，Prosen DE，Mei L，et al A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivlty and improved performance in vitro[J] Xucleic Acids Research，2004；32(3)：1197-1207.

Hiroshi M, et al. Characterization and Application to Hot Start PCR of Neutralizing Monoclonal Antibodies against KOD DNA Polymerase. [J].Synthetic Chemistry and Biological Chemistry.1999, 126(4):762.

周曉薇，朱雪蛟，田玲，等．耐熱Taq DNA聚合酶的酸酐修飾及其在降低PCR非特異性擴增中的應(yīng)用評價[J]．浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，23(3)：500—505．