酶標儀用于檢測鈣離子通路主要通過兩種方式:
1,熒光法?;衔锱c細胞膜上離子通道結合后,改變離子通道狀態,通道打開,鈣離子進入細胞。進入細胞后與細胞內鈣離子熒光指示劑結合,發出熒光后酶標儀捕獲,熒光強度與進入細胞的鈣離子含量成正比。熒光指示劑多用FLuo3,Fluo3-AM是一種可以乙酰甲酯衍生物,可以穿透細胞膜進入細胞,進入細胞后被細胞內的酯酶剪切成FLuo3并滯留在細胞內,鈣離子進入細胞后與之結合,會發出較強的熒光。
2,發光法。水母發光蛋白復合物(Aequorin)由22kDa的水母蛋白(Apoaequorin protein)、分子氧和底物腔腸素組成。只有當鈣離子(Ca2+)與該復合物結合后,腔腸素才能被氧化生成高能量產物Coelenteramide,同時釋放出CO2和藍色熒光(——466 nm)。正是此Ca2+依賴性的反應過程(見圖1),使得腔腸素非常適用于監測活細胞內鈣離子水平。與常規的熒光鈣離子指示劑相比,其主要具有以下幾個優點,1)能檢測較大范圍的鈣濃度 – 從0.1 μM至 >100μM;2)樣品無自體熒光,背景熒光低于使用熒光鈣離子指示劑;雖然信號比使用熒光鈣離子指示劑弱,但是通過成像儀器可以得到更高的信噪比,因此具有更高的靈敏度。3)水母發光蛋白復合體能夠穩定維持在細胞內,使其能夠進行數小時至數天的鈣離子監測。
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