干貨！腦漿組織如何提取外泌體

外泌體是由細胞內多泡體與細胞膜融合后，釋放到細胞外的一種直徑約30 ~ 150 nm的膜性囊泡。幾乎所有的細胞都會產生外泌體，被分泌出的外泌體會進入各種體液，通過循環系統到達其他細胞與組織，產生遠程調控作用。

         越來越多的研究表明神經系統中的生理功能和病理功能與外泌體密切相關，例如：參與神經發育和神經元活動，參與神經退行性疾病調控等。

    本文中整理了一種可以從腦漿組織中分離和提取外泌體的操作步驟，供大家參考！

相關試劑：

1，Hibernate E Solution （BrainBits, Springfield）

2，木瓜蛋白酶papain（Worthington）

3，Umibio Exosome Isolation Kit

4，PBS

相關設備：

1，勻漿器

2，網狀過濾器40-μm

3，注射器過濾器 0.2μm

4，高速離心機

5，渦旋振蕩器

操作步驟：

一）腦漿液化處理：

1，將新鮮或先前冷凍的小鼠半腦切開，加入Hibernate E溶液 (3 mL /半腦)；

2，加入20單位/ mL的木瓜蛋白酶，在37℃水浴15分鐘；

3，加入等體積預冷Hibernate E后，輕輕勻漿；勻漿過程中在冰上進行；

4，腦勻漿通過40-μm網狀過濾器過濾；

5，濾液再通過0.2-μm過濾器過濾，收集濾液；

二）液化腦漿預處理；

1，離心去碎片：將液化腦漿液轉移至離心管中，于4℃以3000 g離心10 min，去除濾液中的碎片；離心后上清液轉移到新的離心管中；

2，離心去雜質：轉移后的上清液于4℃以10000 g離心20 min，去除樣品中雜質，將離心后的上清液轉移至新的離心管中；

三）腦漿外泌體的提取；

通過Umibio Exosome Isolation Kit提取外泌體顆粒。

1，上清液預處理：在去除雜質的離心上清液中加入Exosomoe Concentration Solution（ECS試劑），具體的加入劑量如下：

注：其他劑量規格請根據表中的試劑用量等比例換算

2，溶液混合：加入ECS試劑后將離心管蓋緊，通過渦旋振蕩器混勻1 min，再放置于2℃至8℃靜置2 h；

3，沉淀外泌體：取出裝有混合液的離心管于4℃以10000 g離心60 min，棄上清，沉淀中富含外泌體顆粒；（注：盡可能吸凈上清液）

4，外泌體重懸：取100μL 1×PBS均勻吹打離心沉淀物，待其均勻懸浮在PBS中后，將重懸液轉移至新的1.5 mL離心管中；

5，收獲外泌體顆粒：將含有重懸液的1.5 mL離心管于4℃以12000 g離心2 min，保留上清液，該上清液中富含外泌體顆粒。（注：若離心沉淀物肉眼可見，再離心一次）

6， 純化外泌體：將收獲的外泌體顆粒粗品轉入Exosomoe Purafication Filter（EPF柱）上室中，于4℃以3000 g離心10 min，離心后收集EPF柱管底的液體，此液體即為純化后的外泌體顆粒；

7，外泌體的保存：純化后的外泌體以保存于-80℃低溫冰箱中，以備后繼實驗使用。

參考文獻：

         1， J Biol Chem. 2012 Dec 14;287(51):43108-15.

    2，J Extracell Vesicles. 2017 Jul 26;6(1):1348885.