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產品簡介：

確定基因的轉錄起始位點和終止位點是研究基因結構和功能的最重要工作之一，最-通用的方法是 Frohman 發明 Rapid Amplification of cDNA Ends。其用于確定轉錄起始位點的方法叫 5′RACE 法，用于確定轉錄終點的方法叫 3′RACE 法。它們是通過 PCR 快速克隆 cDNA 末端，在不建立 cDNA 文庫的前提下，利用已知 cDNA 序列設計引物，通過向 mRNA 兩端延伸和擴增獲得兩個末端的序列。本試劑盒就是根據 RACE 技術改良后開發的確定mRNA 3′末端的試劑盒。

產品特點：

1.即開即用，客戶只需要準備總 RNA（或 mRNA）和專一性引物。

2.反應條件經過精心優化，不需要用戶辛苦摸索條件。

3.本產品足夠 10 次 3′RACE 實驗。

4.改良 3′RACE 試劑盒只能用于科研。

產品參數：

成分規格包裝

MMLV 逆轉錄酶-RI 混合液20 μL0.5 mL 紅蓋管

MMLV Buffer-dNTP 混合液50 μL0.5 mL 綠蓋管

2×PCR MasterMix1 mL×22.0 mL 本色蓋

3′RACE 引物 A 干粉10 次0.5 mL 黃蓋管

3′RACE 引物 B 干粉10 次0.5 mL 紫蓋管

3′RACE 引物 C 干粉10 次0.5 mL 白蓋管

RNase-Free 水1 mL2.0 mL 黃蓋管

使用手冊1 份無

運輸及保存

mRNA（或總 RNA）、基因專一性引物 A、基因專一性引物B、超純水。

自備試劑

低溫運輸、-20℃保存、有效期一年。

使用方法：

一：引物的設計和準備工作

利用已知道序列的區域設計基因專一性引物兩條（A、B），其中引物 B 和引物 A 比較，靠 3′端 10-30 個堿基，類似巢式 PCR 的引物設計。基因專一性引物的 Tm 最好跟 3′RACE 引物B 和引物 C 的一致，即 Tm 為 58℃。引物合成后加超純水使其濃度為 10 μM，放冰上待用。

二：利用含 Oligo(dT)的 3′RACE 引物 A 進行逆轉錄

注意：MMLV 酶使用前必須短暫離心，因為它含 50%甘油，及其粘稠，否則將取不到所需體積。如果可能，最好使用Poly(A)RNA 作為模板。

1.在一個 PCR 管中，加入以下組分：

成分用量

mRNA（或總RNA）0.2-2 μg（5 μg） 3′RACE引物A（10μM）1 μL

MMLV Buffer-dNTP混合液5 μL

RNase-Free水補至19 μL 合計18 μL

2.65℃保溫 5 分鐘,展開 RNA 的二級結構，立即冰浴待用。

3.在冰浴的PCR 管中加入 2 μL MMLV 逆轉錄酶-RI 混合物。

4.先 37℃保溫 60 分鐘，再 42℃保溫 30 分鐘進行逆轉錄反應，最后 50℃保溫 10 分鐘終止反應。

5.加入 0.5 mL RNase-free 水稀釋上步得到的 cDNA，冰浴待用。長期放置需要放-20℃保存。

三：利用基因專一性引物A 和試劑盒提供的 3′RACE 引物 B 進行第一輪PCR

6.用不同模板用量進行 4 個 RT 反應液（即稀釋后的cDNA 模板）設置PCR，樣品組需要設置模板用量梯度，單位：μL。

成分梯度1梯度2梯度3梯度4

稀釋后的 cDNA0 μL1 μL5 μL15 μL

自備基因專一性引物 A（10μM）2.5 μL2.5 μL2.5 μL2.5 μL

3′RACE 引物 B（10 μM）2.5 μL2.5μL2.5μL2.5μL

98℃ 5 分變性 RNA-cDNA 雜交鏈，短暫離心后再加入下列成分

2×PCR MasterMix25 μL25 μL25 μL25 μL

RNase-free 水20 μL19 μL15 μL5 μL

合計50 μL50 μL50 μL50 μL

7.按下列參數進行 cDNA 第二鏈的合成和PCR：

第 1 步，cDNA 第二鏈的合成：52-60℃ 2 分，72℃ 40 分（此步的目地是合成第二鏈的 cDNA，復性溫度需要根據自備基因專一性引物 A 的 Tm 值決定，一般可以從 55℃開始）。

第二步 PCR 循環 30 次：94℃ 1 分鐘，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分，循環 30 次后， 最后 72℃延伸 15 分。PCR 擴增的復性溫度需要根據自備基因專一性引物A 的 Tm 值決定，一般可以從 55℃開始。

8.取 5 μL PCR 反應液進行瓊脂糖凝膠電泳以確認PCR 擴增產物。若得到目的擴增產物需要用于后續實驗，請于-20℃保存；若沒有得到目的擴增產物，可按下列步驟進行巢式 PCR 反應。

四：利用基因專一性引物B 和試劑盒提供的 3′RACE 引物 C 進行巢式PCR 反應

9.將上輪 PCR 產物（4 管）用水稀釋約 20 倍（在 50 μL PCR 反應液中加入 1 mL

自備的超純水），然后分別作為模板進行巢式 PCR 擴增。PCR 反應設置如下：

成分1-4管

2×PCR MasterMix各 25 μL 上步得到的 PCR 反應液（稀釋 20 倍后）4 種之一 1 μL

自備的基因專一性引物 B（10 μM）2.5 μL 試劑盒提供的 3′RACE 引物 C（10 μM）2.5 μL

超純水補至 50 μL

10.PCR 反應。按下列條件進行 PCR：

第 1-30 次循環：94℃ 1 分鐘，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分（復性溫度需要根據自備基因專一性引物 B 的 Tm 值進行優化，一般可以從 55℃開始）。最后延伸：72℃ 15 分鐘。

11.電泳檢測。然后根據實驗結果進行切膠回收并 TA 克隆，選 5-10 個單菌落進行測序。

選擇我們的改良 3′RACE 試劑盒，就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！