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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

分枝桿菌屬（Mycobacterium spp.）是一類細(xì)長略彎曲的，有時(shí)有分枝或出現(xiàn)絲狀體的細(xì)菌。本屬細(xì)菌的主要特點(diǎn)是細(xì)胞壁含有大量脂質(zhì)，主要是分枝菌  酸。這和其染色性、生長特性、致病性、抵抗力等密切相關(guān)。一般不易著色，若  經(jīng)加溫或延長染色時(shí)間而著色后能抵抗強(qiáng)脫色劑鹽酸乙醇的脫色，故又稱抗酸桿  菌。該菌屬無鞭毛、無芽胞、不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素，其致病性和菌體成分有關(guān)。引  起的疾病都呈慢性，并伴有肉芽腫。分枝桿菌種類較多，對(duì)人致病的主要有結(jié)核  分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)分枝桿菌屬的試劑盒。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到 100 拷貝/反應(yīng)。

3.提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)分枝桿菌屬細(xì)菌 DNA 的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.本產(chǎn)品既可用于定性檢測(cè)，也可以用于定量檢測(cè)，用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍  至少有 5 個(gè)數(shù)量級(jí)。

6.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。

7.分枝桿菌屬通用探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50T/盒，可滿足一定規(guī)模的檢測(cè)需求。

檢測(cè)方法

實(shí)時(shí)熒光PCR，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。

試劑盒成分

2×Probe qPCR MasterMix、熒光 PCR 專用模板稀釋液、超純水、分枝桿菌屬通用 qPCR 引物-探針干粉、分枝桿菌屬通用qPCR 陽性對(duì)照(1E7 拷貝/μL)、使用手冊(cè)。

自備試劑

樣品 DNA，超純水，核酸純化試劑盒。

保存和運(yùn)輸

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 24 個(gè)月。

使用方法：

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 1E1-1E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污

染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本  產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對(duì)照。1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1分鐘，得 1E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5 μL 1E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性

對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL 上步所得 4 號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積  一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8.用自選方法純化樣品的 DNA，本擴(kuò)增試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)細(xì)菌 DNA- 提取試劑盒兼容。也可以使用本公司的核酸-提取試劑。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（直接用第 6 步第 4 號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)  置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好  后最后加）：

成分樣品管

N+2 個(gè)PCR 陰性

對(duì)照管標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管

（1-6 管）

2×Probe qPCR

MasterMix10μL10μL各 10μL

分枝桿菌通用探針法 qPCR

引物-探針混合液3μL3μL各 3μL

N+2 個(gè)待測(cè) DNA 模板7μL不加不加

超純水不加7μL不加

第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（1-6 號(hào)）

不加

不加各 7μL（1 號(hào)樣到 1號(hào)管，2 號(hào)樣到 2 號(hào)

管…）

12.如果樣本制備陽性對(duì)照或 PCR 陽性對(duì)照(包括標(biāo)曲樣本)結(jié)果為陰性，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重新樣本制備，重新進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增或跟廠家聯(lián)系。如果樣本制備陰性對(duì)照或 PCR 陰性對(duì)照結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系。

13.如果陰性對(duì)照和陽性對(duì)照均正常，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

15.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照必須無 Ct 或 Ct 大于或等于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于 40，否則實(shí)驗(yàn)無效。如果實(shí)驗(yàn)有效，則分析待測(cè)樣品，如果無

Ct 或 Ct 大于或等于 40，則為陰性。如果 Ct 小于 40 則為陽性。

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