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羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR儀說明書
羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR儀說明書
一、儀器概述
羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR儀是一種基于實時熒光定量PCR（qPCR）技術的分子生物學檢測設備，用于核酸（DNA/RNA）的擴增和定量分析。該儀器采用光學檢測系統，可在PCR擴增過程中實時監測熒光信號變化，并通過軟件分析計算目標核酸的初始濃度。
LightCycler® 480適用于醫學診斷、基礎研究、食品安全檢測、環境監測等領域，支持多重PCR檢測，滿足不同實驗需求。
二、儀器組成
1. 硬件部分
溫控模塊：采用Peltier半導體溫控技術，控溫范圍通常為4°C–99°C，升降溫速率可達4.8°C/秒（視具體型號）。
光學檢測系統：
激發光源：LED或鹵素燈（視型號）。
檢測通道：通常支持4–6個熒光通道（如FAM、HEX、ROX、Cy5等），可同時檢測多種熒光信號。
樣本承載系統：兼容96孔板或384孔板（視型號），部分版本支持多模塊并行運行。
觸摸屏控制面板（部分型號）：可直接進行基本操作和程序設定。
2. 軟件部分
LightCycler® 480 Software：提供實驗設置、數據采集、分析和報告生成功能。
支持絕對定量、相對定量、熔解曲線分析、基因分型等模式。
可導出數據至Excel、PDF等格式。
三、工作原理
實時熒光定量PCR（qPCR）通過監測PCR擴增過程中熒光信號的累積來定量目標核酸。LightCycler® 480采用以下兩種主要檢測方式：
基于探針的檢測（如TaqMan探針）：探針與目標序列結合后，在擴增過程中被酶切，釋放熒光信號。
基于染料的檢測（如SYBR Green）：染料結合雙鏈DNA后發出熒光，但可能受非特異性擴增影響。
儀器在每輪PCR循環后采集熒光信號，生成擴增曲線，并通過閾值循環數（Ct值）計算初始模板量。
四、操作流程
1. 實驗前準備
樣本處理：提取DNA/RNA，測定濃度和純度（如A260/A280比值）。
試劑準備：
選擇合適熒光標記（探針或染料）。
配制PCR反應體系（模板、引物、探針、酶、dNTPs、緩沖液等）。
耗材選擇：使用適配的96孔板或384孔板，避免氣泡影響信號檢測。
2. 儀器設置
開機與初始化：
打開儀器電源，啟動軟件，進行光學校準（如需要）。
創建實驗程序：
設定PCR循環參數（預變性、變性、退火/延伸、循環次數）。
選擇熒光檢測通道（如FAM、HEX）。
樣本排布：
在軟件中設定樣本位置，標注標準品、待測樣本、陰性/陽性對照。
3. 運行PCR
將反應板放入儀器，啟動運行。
實時監測擴增曲線和熒光信號。
4. 數據分析
擴增曲線分析：軟件自動計算Ct值，生成標準曲線（絕對定量）或ΔΔCt值（相對定量）。
熔解曲線分析（如使用SYBR Green）：確認擴增特異性。
數據導出：保存或打印結果。
五、應用領域
醫學診斷：
病原體檢測（如新冠病毒、HIV、HBV）。
遺傳病篩查（如地中海貧血、囊性纖維化）。
科研實驗：
基因表達分析（qRT-PCR）。
SNP分型、突變檢測。
食品安全與農業：
轉基因成分檢測。
食源性致病菌（如沙門氏菌、大腸桿菌）鑒定。
環境監測：
水體或土壤中的微生物檢測。
六、注意事項
1. 實驗優化
引物/探針設計：確保特異性，避免二聚體或非特異性擴增。
反應體系優化：調整Mg2?濃度、退火溫度等參數。
2. 防污染措施
分區操作（試劑配制區、樣本處理區、擴增區）。
使用UNG酶（尿嘧啶-DNA糖基化酶）防污染體系。
3. 儀器維護
日常清潔：定期用無塵布擦拭樣本槽和光學部件。
校準：定期進行光學校準和溫度驗證。
避免長時間高負荷運行，以延長設備壽命。
七、常見問題與解決方案
| 問題 | 可能原因 | 解決方法 |
|---|---|---|
| 無熒光信號 | 試劑失效、探針降解 | 更換新鮮試劑，檢查探針質量 |
| 擴增曲線異常 | 模板降解、PCR抑制物 | 重新提取核酸，優化純化步驟 |
| 重復性差 | 加樣誤差、溫度不均 | 使用排槍精確加樣，檢查溫控模塊 |
八、技術參數（以LightCycler® 480 II為例）
溫控范圍：4°C–99°C
升降溫速率：最高4.8°C/秒
檢測通道：6色熒光（FAM、HEX、ROX、Cy5等）
通量：96孔或384孔（視型號）
數據輸出：Ct值、熔解曲線、基因分型等
九、總結
羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR儀通過高精度溫控和多重熒光檢測，為核酸定量分析提供穩定可靠的技術支持。其應用范圍廣泛，但實驗結果的準確性依賴于合理的實驗設計、規范操作和定期維護。用戶應根據具體需求選擇合適的檢測模式和耗材，并遵循標準化流程以確保數據可靠性。