分離囊胚的內(nèi)細胞群（ICM）細胞，再進行體外培養(yǎng)即可取得胚胎干細胞。目前，取得胚胎干細胞的方法已有一定改進，但仍無可避免地會
殺死胚胎。
囊胚由兩大部分構(gòu)成：處于外圍的滋養(yǎng)層以及處于內(nèi)部的內(nèi)細胞群。滋養(yǎng)層細胞會分化為胚胎外的組織（胎盤等），而內(nèi)細胞群則會分化為
胚胎的各種結(jié)構(gòu)。
最早期分離胚胎干細胞的方法是先用蛋白酶分解透明帶的蛋白質(zhì)（囊胚外圍的一層細胞外基質(zhì)），再利用免疫手術(shù)（immunosurgery）
專一地使滋養(yǎng)層細胞裂解，從而取得內(nèi)部的內(nèi)細胞群細胞，之后體外培養(yǎng)和繁殖取得的內(nèi)細胞群細胞，即可建立胚胎干細胞系。
目前胚胎干細胞的分離方法已有了一定的改進，比如現(xiàn)在已有使用激光去除透明帶的技術(shù)。
獲取胚胎干細胞的成功率相當?shù)停词钩晒θ〉门咛ジ杉毎S持其不分化的狀態(tài)也十分困難。為了阻止胚胎干細胞在培養(yǎng)過程中分化，
培養(yǎng)基需加入如白血病抑制因子（LIF）等因子。最初，胚胎干細胞需要在含有喂養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
喂養(yǎng)層細胞能為胚胎干細胞提供特定的微環(huán)境，以抑制胚胎干細胞的分化。喂養(yǎng)層細胞常常使用經(jīng)過有絲分裂阻斷劑處理過的胚胎成纖維細胞
。目前已能在成分清楚、無異物、不含有血清以及喂養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)基上培養(yǎng)胚胎干細胞。
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