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免疫熒光染色封片技巧

閱讀:624      發布時間:2024-7-17
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免疫熒光染色是實驗室常用的技術之一,但在操作過程中,有許多需要注意的細節,任何一個環節的失誤都可能導致實驗失敗。本文將為您介紹免疫熒光染色的注意事項。




1. 抗體選擇:選擇針對您研究的目標蛋白特異性高、親和力強的抗體,一抗的濃度需要預實驗摸索。一抗濃度過高(本身熒光實驗,一抗的濃度就較高),也是造成自發熒光強的重要原因。




2. 抗體稀釋:根據抗體說明書建議,使用合適的稀釋液和稀釋比例進行抗體稀釋。




3. Blocking:使用合適的Blocking 液進行Blocking 處理,以減少非特異性結合,一般采用動物血清,在室溫下封閉1h左右。建議適當延長封閉的時間至2h。如果室溫較低,可以考慮采用37℃孵育箱進行封閉,優化封閉時間,充分去除組織中的類屬抗原。




4. 二抗選擇:選擇與一抗種屬匹配的熒光標記二抗,二抗在4℃長時間放置后可能有部分熒光素沉淀,導致染色結果有星星點點的雜質,損失珍貴樣本!建議配成工作液后,高速離心,取上清使用。




5. 洗滌:在每一步操作后,充分洗滌以去除未結合的抗體和染料。




6. 封片:選擇合適的封片劑進行封片,避免熒光淬滅。




7. 對照設置:設置合適的陽性和陰性對照,以確保實驗結果的可靠性。





封片技巧:



在滴加封片劑之前,確保切片上沒有多余的液體。封片劑也不宜添加過多,可用10ul槍頭吸取少量,點在每個樣品邊緣,緩慢蓋片。




滴加適量的封片劑,避免產生氣泡。


用10ul槍頭滴加~5ul/樣品(根據組化筆大小 酌情更改封片劑滴加量) 千萬不可打出氣泡!不要把槍頭最后一滴封片劑打出!氣泡會嚴重影響封片效果!


如果不小心產生氣泡 → 可以用鑷子輕輕將氣泡擠出。




使用干凈的蓋玻片,輕輕按壓,使封片劑均勻覆蓋切片。




避免在蓋玻片上留下指紋或污漬。


希望 這些技巧能幫助您順利完成實驗。


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