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WB過程中如何保證的蛋白轉印
閱讀：324 發布時間：2015-4-27在WB過程中從SDS-PAGE膠上轉移蛋白至膜上是非常關鍵的步驟！優化轉移時間往往需要實驗多次，下面就講幾條關于如何保證蛋白*轉移的小技巧，適合新手參考:
使用預染的marker 預染marker不僅能夠直觀的觀察到跑膠情況，而且在轉移過程中也是很好的工具，在完成印跡后觀察膜上的 marker ，看是否所有條帶都已經轉移至膜上。
在轉印裝置中加兩塊膜 小分子量的蛋白轉移的比較快，而為保證大分子蛋白的轉印，長時間的轉印可能使小分子蛋白透過膜，因此，可以加入兩塊膜，如果能在第二塊膜上檢測到小分子蛋白，說明轉印時間過長。
在轉印后對膠染色 如果轉印時間不夠優化，通過對膠染色，在膠上能夠觀察到未轉移*的蛋白，這種情況在轉印大分子蛋白是常見，使用銀染或者考馬斯亮藍的方法都可以。
二、Western blot轉印的優化
從SDS凝膠中進行Western蛋白轉印的優化需要對一系列參數進行考慮。目的是轉印所有凝膠上的蛋白并將其定量地轉移到轉印膜上。進行轉印需要一定程度的優化，尤其是對于大分子量和小分子量蛋白。
轉印后，凝膠上應不殘留或殘留很少的蛋白。可以在轉印后進行染色進行檢測。轉移出凝膠的蛋白應該僅在接觸凝膠的膜的一面可見。如果有懷疑，在轉印時使用第二個"支持膜"，你可以在轉膜后染色，以檢查是否有穿膜的跡象。如果發現蛋白殘留在凝膠上而且膜的結合性很差，可以考慮下列因素：
SDS vs 甲醇
在多數轉印實驗步驟中都使用SDS和甲醇。但兩者對于成功的轉印有相反的作用，需要根據欲轉印蛋白的性質加以優化。
SDS對于蛋白的遷移是必要的，尤其有助于大分子量蛋白從凝膠上的轉移。但由于膜結合需要疏水相互作用，SDS過多會抑制結合，尤其對于硝酸纖維素膜。作為一個一般性的規則，如果膜的結合力有效，但蛋白仍舊殘留在凝膠上，在轉印緩沖液中加入 0.1％SDS會促進*轉印。但另一方面，甲醇通過在蛋白上剝離SDS，促進蛋白和膜的疏水結合。一般在轉印緩沖液中加入20％的甲醇會增加硝酸纖維素膜的結合能力。
凝膠濃度
丙烯酰胺濃度越低，蛋白越容易轉移下來。選擇可以分離蛋白的濃度zui低的凝膠。梯度膠適用于轉印一系列不同大小的蛋白，因為凝膠的孔與不同大小的蛋白匹配良好。
凝膠厚度
蛋白比較易于從薄膠上轉移下來，所以如果上樣體積允許，使用1.0mm厚的膠取代1.5mm的膠。
電場（電壓×時間）
如果電壓過低而且轉印時間過短，部分蛋白會殘留在凝膠上。如果電壓過高，小蛋白會在結合到膜上前透膜而出。如果按建議的條件轉印后有蛋白殘留在膠上，增加電壓可能會有幫助，但不要超過5V。
膜的類型
蛋白結合到硝酸纖維素膜上主要通過疏水鍵。PVDF膜比硝酸纖維素膜更疏水，在轉印過程中結合蛋白更緊密，可以耐受更多的SDS。目前，PVDF膜一般比硝酸纖維素膜需要更嚴謹的封閉條件，其適用于蛋白印跡。尼龍膜通過疏水和靜電相互作用結合，其SDS耐受度甚至高于PVDF膜，但也需要更嚴謹的封閉條件，主要建議用于Northern和 Southern。