過度的脂質過氧化通過產生有毒的磷脂氫過氧化物（PLOOH），在促進鐵死亡中起著重要作用。因此，脂質過氧化相關的生物標志物是鐵死亡的關鍵檢測指標。

1.1 脂質過氧化物檢測

BODIPY 581/591 C11 是一種脂溶性比率型熒光探針，能夠嵌入細胞膜并與細胞內的脂質相互作用。在未氧化狀態下，呈現紅色熒光 (還原型；Ex=581 nm, Em=591 nm)。

當細胞發生鐵死亡時，亞鐵離子 (Fe2+) 和 ROS 促進脂質氧化，形成脂質過氧化物，BODIPY 581/591 C11 被氧化，發射波長從 591 nm 轉移到 510 nm，產生綠色熒光 (氧化型；Ex=500 nm, Em=510 nm)。

需要注意的是，BODIPY 581/591 C11 對脂溶性膜內各種活性氧 (ROS) 和過氧亞硝酸鹽 (ONOO-) 也較為敏感，因此它也可以用于鐵死亡細胞中 ROS 和 RNS 的檢測。

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BODIPY 581/591 C11 染色參考

1. 儲備液及工作液的制備:

 (1) 用 DMSO 配制 10 mM BODIPY 581/591 C11 儲備液（-20°C 或 -80°C 避光保存，避免反復凍融）。

 (2) 染色前用無血清細胞培養基或 PBS 稀釋儲備液，制備 2-10 μM BODIPY 581/591 C11 工作液

 （請根據實際情況調整工作液濃度）。

2. 細胞染色：

 (1) 細胞制備

 懸浮細胞：4°C, 1000 ×g 離心 3-5 分鐘，棄上清。PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘。

 貼壁細胞：棄去培養基，加入胰蛋白酶解離細胞，制成單細胞懸液。4°C, 1000 ×g 離心 3-5 分鐘，棄上清。

 PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘。

 (2) 加入 1 mL BODIPY 581/591 C11 工作液，室溫孵育 30 分鐘。

 (3) 4°C, 400 ×g 離心 3-4 分鐘，棄上清。PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘。

 (4) 用 1 mL 無血清細胞培養基或 PBS 重懸細胞，熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測。

1.2 活性氧的檢測[20]

活性氧（ROS） 在鐵死亡過程中不僅促進脂質過氧化和細胞損傷，還抑制抗氧化信號通路，是鐵死亡檢測的重要生物標志物。H2DCFDA（DCFH-DA）是一種可滲透細胞的活性氧探針。進入細胞后，H2DCFDA 在細胞內脫酯化，并被 ROS 氧化成具有強烈熒光的 DCF，產生綠色熒光（Ex: 488 nm, Em: 525 nm）。通過熒光顯微鏡、流式細胞儀或分光光度計等設備可以檢測細胞內 ROS 水平。

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H2DCFDA 染色方法參考

1. 儲備液及工作液的制備 :

 (1) 用DMSO配制5mM的H2DCFDA儲備液（-20°C或 -80°C避光保存，避免反復凍融）。

 (2) 染色前用無血清細胞培養基或PBS稀釋儲備液，配制成1-10μM的H2DCFDA工作液。

 （請根據實際情況調整工作液濃度）。

2. 細胞染色：

 (1) 懸浮細胞

 · 離心收集細胞，保持密度約為1×106

 個。PBS洗滌兩次，每次5分鐘。

 · 加入1mL 染料工作液，室溫孵育5-30分鐘。

 · 400×g離心3-4分鐘，棄上清。PBS洗滌細胞兩次，每次5分鐘。

 · 用1mL無血清培養基或PBS重懸細胞，使用熒光顯微鏡或流式細胞儀進行觀察。

 (2) 貼壁細胞

 · 將貼壁細胞培養于無菌蓋玻片上。

 · 從培養基中移出蓋玻片，置于載玻片上，吸除多余培養基。加入 100 μL 染料工作液，

 輕輕晃動使其完-全覆蓋細胞，孵育 5-30 分鐘。

 · 吸去染料工作液，培養基洗 2-3 次，每次 5 分鐘，使用熒光顯微鏡觀察。

注：若需要用流式細胞儀檢測，需將細胞用胰蛋白酶消化并重懸后再進行染色。

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1.3 過氧化脂質衍生物的檢測[21][22]

脂質過氧化反應過程中，大量的脂質過氧化初級產物在氧化反應中逐漸分解為一系列復雜的醛類化合物，包括 MDA，4-HNE，丙醛和己醛等。這些活性醛類物質能夠攻擊蛋白質等生物大分子，形成加合物，從而引發細胞的進一步損傷。

Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit 是一種基于硫代巴比-妥酸 (TBA) 反應物法的試劑盒，脂質過氧化產物 MDA 與 TBA 在高溫和酸性條件下反應，形成一種具有特定顏色的 MDA-TBA 復合物，其最大吸收波長通常在 532 nm 處，可通過比色法來定量檢測脂質過氧化水平。

此外，4-HNE 抗體可以用來定量檢測 4-HNE 水平。需要注意的是，MDA 和 4-HNE 在除鐵死亡外的多種氧化應激狀態下均可產生，在實際應用中，一般與其他檢測方法進行相互驗證，以提高結果的可靠性和準確性[10]。

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