目錄:北京蘭博利德商貿(mào)有限公司>>分子生物學(xué)試劑>>PCR相關(guān)>> T12122xLab SuperHiFi PCR Master Mix（含染料）
| 供貨周期 | 一周 | 規(guī)格 | 1ml |
|---|---|---|---|
| 貨號 | T1212 |
2xLab SuperHiFi PCR Master Mix（含染料）
貨號：T1212
儲存條件：-20℃
產(chǎn)品組成：
組分 | 規(guī)格 S | 規(guī)格 M | 規(guī)格 L |
2× Lab SuperHF PCR Master Mix（含染料） | 1 ml | 5×1 ml | 20×1 ml |
2.5× PCR Enhancer | 1 ml | 1 ml | 5×1 ml |
產(chǎn)品簡介：
2xLab SuperHiFi PCR Master Mix（含染料）是即用型2×預(yù)混合溶液，包含Lab Super High-Fidelity DNA Polymerase、dNTPs 和精心優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，只需加入模板、引物和水即可進(jìn)行高保真PCR反應(yīng)。本產(chǎn)品適用于以基因組DNA、cDNA、質(zhì)粒以及粗品為模板的PCR反應(yīng)。預(yù)混液中包含紅色和黃色示蹤染料，可將產(chǎn)物直接用于凝膠電泳。預(yù)混液中的紅色染料與1500 bp 雙鏈DNA片段在1%瓊脂糖凝膠中遷移速率接近;黃色染料與10 bp雙鏈DNA片段在1%瓊脂糖凝膠中遷移速率接近。
產(chǎn)品特點：
1. 保真度高，擴(kuò)增速度快：保真度是普通Taq酶的70倍，擴(kuò)增速度是Pfu的5倍。
2. 擴(kuò)增片段長度長：使用λDNA、質(zhì)粒等簡單模板時，可以輕松擴(kuò)增長達(dá)20 kb的片段；而使用基因組DNA等復(fù)雜模板時，能有效擴(kuò)增長達(dá)12 kb的片段。
3. 2× Lab SuperHF PCR Master Mix對PCR抑制劑具有良好的耐受能力，對粗提樣本也能進(jìn)行很好的擴(kuò)增。
反應(yīng)體系：
試劑 | 使用量 |
2× Lab SuperHF PCR Master Mix（含染料） | 25 μl |
2.5× PCR Enhancer（可選） | 10 μla |
上游引物 (10 μM) | 1 μl |
下游引物 (10 μM) | 1 μl |
模板 | x μl |
ddH2O | Up to 50 μl |
模板用量：
模板種類 | 推薦用量 |
基因組DNA | 10~200 ng |
質(zhì)粒或病毒DNA | 10 pg~50 ng |
cDNA | 1~5 μl (不超過PCR反應(yīng)總體積的1/10) |
粗品 | 1~5 μl (不超過PCR反應(yīng)總體積的1/10) |
a. 當(dāng)擴(kuò)增片段 GC 含量 >60% 且優(yōu)化條件也無法正常擴(kuò)增時，推薦使用 2.5×PCR Enhancer來優(yōu)化 PCR 反應(yīng)。與無染料的2× S705 HiFi Master Mix（T1211）相比，T1212所需的PCR Enhancer更少，請避免加入過量Enhancer導(dǎo)致擴(kuò)增失敗程序推薦：Touchdown PCR（降落 PCR）程序。
反應(yīng)程序：
①三步法：
步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
預(yù)變性b | 95oC | 3-5 min | 1 |
變性 | 95oC | 10 s |
30-35 |
退火c | 55~72oC | 15s | |
延伸d | 72oC | 30 s/ kb | |
終延伸 | 72oC | 5 min | 1 |
4-8oC | Hold |
b. 對于普通模板，預(yù)變性可縮短至30~60 s；對于復(fù)雜模板，例如高 GC 序列，推薦延長預(yù)變性時間到3~5 min 以充分變性；
c. 根據(jù)引物 Tm 值設(shè)置退火溫度。如引物Tm值≥72℃，可刪除退火步驟，直接進(jìn)行后續(xù)的延伸步驟(兩步法PCR)。如果需要，可以建立一個溫度梯度尋找引物與模板結(jié)合的最適溫度。此外，退火溫度直接決定擴(kuò)增特異性。如發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增特異性差，可適當(dāng)提高退火溫度;
d. 對于大多數(shù)模板，30s/kb即可有效擴(kuò)增; 對于一些復(fù)雜模板，可延長延伸時間至30~60 s/kb。
②兩步法e：
步驟 | 溫度 | 時間 |
|
預(yù)變性 | 95oC | 3-5 min | 1 |
變性 | 95oC | 10 s | 30-35 |
退火&延伸 | 65~68oC | 30 s/ kb | |
終延伸 | 72oC | 5 min | 1 |
4-8oC | Hold |
e. 通常情況下使用兩步法和三步法進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，性能無顯著差異，可以根據(jù)操作習(xí)慣自行選擇。但對于一些復(fù)雜模板(如長片段，Tm 分布不均勻，特殊結(jié)構(gòu)模板)，可以嘗試兩步法或者Touchdown PCR (降落PCR)法。此外，使用質(zhì)粒為模板進(jìn)行點突變時，也建議使用兩步法。
③Touchdown PCR（降落 PCR）f法：
步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
預(yù)變性 | 95oC | 3-5 min | 1 |
變性 | 95oC | 10 s |
30-40 |
退火 | 68℃ (-0.2℃/cycle) | 15s | |
延伸 | 72oC | 30 s/ kb | |
終延伸 | 72oC | 5 min | 1 |
4-8oC | Hold |
f. 該程序僅供參考，Touchdown PCR (降落PCR)有多種程序可靈活調(diào)整，請根據(jù)實驗需求與習(xí)慣自行決定是否采用。
注意事項：
1. 請不要使用含尿mi啶的引物和模板。
2. Lab Super High-Fidelity DNA Polymerase具有較強(qiáng)的校正活性，產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物是平末端，如果用于下一步克隆實驗，建議使用平末端克隆。如果擴(kuò)增產(chǎn)物需要用于TA克隆，加A之前須*行DNA純化。
3. 為了提高擴(kuò)增成功率和產(chǎn)量，請使用高質(zhì)量的模板。
4. 請設(shè)置PCR儀程序時選擇“Tube"而不是“Block"模式，部分機(jī)型兩種模式升降溫差異較大，“Block"模式可能導(dǎo)致復(fù)雜模板擴(kuò)增失敗。
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