在進行酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent  assay，ELISA）實驗中，有很多需要注意的地方，由于ELISA方法廣泛應用在各種抗原和抗體的此定中。但是測定中的影響因素很多，并且對操作有較高的要求，所以，在實驗中除了正常的相互反應，還會出現錯誤的反應，導致錯誤的結果。
而造成這種錯誤的可能因素有：標本因素；試劑因素；操作因素等。
為此，上海勁馬針對常見問題做分析如下：這里我簡單的總結一下：

ELISA 試劑盒標準操作要點

無論在什么研究中，優質的試劑、良好的和正確的操作是保證ELISA 檢測結果準確可靠的必要條件。ELISA  中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質量的純化水電導率小于1.5μs/cm。

A  標本的采取和保存
      大部分ELISA  檢測均以血清為標本。血清標本可按常規方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP 為標記的ELISA  測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會產生假陽性反應。一般說來，在5  天內測定的血清標本可放置于4℃，標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG  聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需－20℃保存。凍結血清融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產生氣泡。混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。
      保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑。
      抗凝不*的標本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。

B  加樣
      加樣時應將所加物加在ELISA  板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。

C  保溫
      在建立ELISA  方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2  小時，為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應，邊上的值會偏高，建議為了客觀的判斷結果，將質控放在非邊緣位置。

D  洗滌
      洗滌在ELISA 試劑盒過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELSIA  就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。可以說在ELISA  操作中，洗滌是最主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。
      洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
      洗板時注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋，應按要求稀釋，所用的水電導率最好在1.5us/cm  之下，洗液如果結晶應待其融解后配制。保證洗板浸泡時間為40  秒左右，孔內液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內形成氣泡。

E  顯色和比色
TMB 經HRP 作用后，約40  分鐘顯色隨即逐漸減弱，至2 小時后即可*消退至無色。TMB  的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24  小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指專用于測讀ELISA  結果吸光度的光度計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優良的酶標儀的讀數一般可精確到0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15~30℃，使用前先預熱儀器15-30  分鐘，測讀結果更穩定。
      測讀A 值時，要選用產物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm  波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不 移動ELISA 板的位置，最終測得的A  值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。