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細(xì)胞名稱：HTMC，人眼小梁網(wǎng)細(xì)胞

種屬來源：人

組織來源：眼

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

生長特性：貼壁生長

培養(yǎng)基:：90%DMEM-F12+10% FBS

生長條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳；溫度：37℃

傳代方法：1:2 至 1:3，每周 3 次

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲(chǔ)存

支原體檢測：無

復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1 mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL 培養(yǎng)基混合均勻。在 1000 rpm 條件下離心 3 min，棄去上清液，加 1-2 mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入 10 cm 皿中，加入約 8 mL 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第2天換液并檢查細(xì)胞密度。

細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細(xì)胞 1-2 次。

b、加 1 mL 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于 37℃培養(yǎng)箱中消化 1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按 6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm 離心 4 min，棄去上清液，補(bǔ)加 1-2 mL 培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按 1:2 比例分到新的含 8 mL 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

下面 T25  瓶為例：

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm 條件下離心 4 min，棄去上清液，用 PBS 清洗一遍，棄盡 PBS，加 1 mL 血清重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度 5×10^6~1×10^7/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存 1mL 細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)記。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h 后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

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