5
PriCells: 正常大鼠前脂肪細胞的培養
正常大鼠前脂肪細胞的培養
實驗材料：
1. 細胞來源：4周齡雄性Wistar或其它品系大鼠；
2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.4；
3. 消化液：2mg/ml膠原酶溶液。用DMEM培養液配制，并加入牛血清白蛋白20mg/ml；
4. 培養液a：DMEM培養液，10%胎牛血清、100IU/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素；
5. 培養液b：在培養液a中補充生物素33μmol/L與泛酸鹽（pantothenate）17μmol/L；
6. 培養液c：基礎培養液為DMEM/Ham F12（1：1，V/V）混合培養液，加入NaHCO3 15mmol/L、HEPES 15mmol/L，pH7.4。再加入生物素33μmol/L與泛酸鹽17μmol/L及100IU/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素；
7. ITT培養液：在培養液c的基礎上添加胰島素5μg/ml、轉鐵蛋白10μg/ml和三碘甲腺原氨酸（T3）200pmol/L；
8. 篩網：孔徑為25μm的尼龍網篩；
實驗方法：
1. 取材；
1） 取用普通食物喂養的4周齡雄性大鼠，yi醚麻醉后斷頭處死；
2） 在無菌條件下從附睪周圍切取脂肪墊，放入培養皿中。盡量除去血管。然后用清洗液沖洗3次；
2. 分離細胞；
1） 充分剪碎所取脂肪細胞。然后放入消化液中，37℃水浴中振蕩消化40min；
2） 將含有細胞和殘余組織塊的消化液倒入加有培養液a的燒杯中，用吸管反復吹打。然后通過孔徑為25μm的尼龍網篩。分別收集濾液和未濾過的組織塊；
3） 將濾液以600g離心5min，棄上清液。在管中加入培養液b，制成SV細胞懸液，暫存入4℃冰箱中；
4） 合并兩次制備所獲的SV細胞懸液。用吸管吹打混勻。取少量SV細胞懸液，計數細胞。注意在計數時不要計入血細胞。根據需要調節細胞密度；
3. 原代培養；
1） 以104個/cm2的密度將細胞接種于培養皿中，加入培養液b。于37℃、3.5%CO2培養箱中培養12—24h；
2） 在細胞貼壁后，用培養液c清洗2次。然后加入培養液c過度培養1h；
3） 棄瓶中的培養液c，用PBS洗細胞2次；
4） 以后用ITT培養液維持培養。每3d換液一次；
PriCells提供：
1. 各種原代細胞特制基礎培養基；
2. 各種原代細胞培養特制添加劑；
3. 原代細胞分離試劑盒；
4. 原代細胞鑒定試劑盒；
5. 原代細胞總蛋白質抽提物；
6. 原代細胞總RNA；
7. 原代細胞總DNA；