熒光濾光片一般采用單片無色透明的玻璃作為基底，在玻璃的兩個表面鍍膜。增反膜的厚度會選擇為半波長的整數倍，此時反射疊加增強；增透膜的厚度為1/4波長的倍數，此時投射疊加增強。
熒光團會被高頻率的照明(紫外、紫色或藍色光譜區域內的波長)激發或吸收能量，然后會在頻率較低的照明(綠色、紅色或近紅外光譜區域內的波長)中發射該能量。每種熒光團都具備了能夠高效吸收能量的波長，又稱為峰值激發波長λ (nm)，以及能夠將所吸收到的多能量重新發射的對應波長，又稱為峰值發射波長λ (nm)。選擇單獨熒光濾光片以及大透射的波長將能夠確保您獲得清晰度高的熒光圖像。
熒光濾光片日常須注意：
1、濾光片的順序不能顛倒，最靠近光源處為吸熱濾光片，次之應放置激發濾光片組合，而后為被檢標本，最后安放阻擋濾光片，這是透射熒光顯微鏡的濾光片使用順序。在落射熒光顯微鏡應用中在激發濾光片和被檢標本之間必須加進色光分離反射濾光片(FT或RKP)。
2、使用濾光片時必須遵守斯托克斯定律：吸熱濾光片的透射波長<激發濾光片的透射波長<色光分離反射濾光片的透射波長<阻擋濾光片的透射波長。
3、使用濾光片時必須注意配用濾光片的透射譜線之間越是相互靠近越好。
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