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上海晅科生物科技有限公司>>技術文章>>霍亂弧菌O139(VC O139)核酸檢測試劑盒的操作使用

霍亂弧菌O139(VC O139)核酸檢測試劑盒的操作使用

閱讀:1428        發布時間:2023/4/11
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霍亂弧菌O139(VC O139)核酸檢測試劑盒適用于ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
1、試劑配制(試劑準備區)
根據待檢測樣本總數,設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應管數每滿10份,多配制 1份),每測試反應體系配制如下表:將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,21μL/管。

2、加樣(樣本處理區)
將步驟1提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取4μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻, 短暫離心。
3、 PCR擴增(核酸擴增區)
3.1  將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內;
3.2  設置好通道、樣品信息,反應體系設置為25μL;
熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI系列儀器請勿選擇ROX參比熒光,選擇None即可。
3.3  推薦循環參數設置:

4、結果分析判定
4.1  結果分析條件設定
設置Baseline和Threshold:一般直接按機器自動分析的結果分析,當曲線出現整體傾斜時,根據分析后圖像調節Baseline的start值(一般可在3~15范圍內調節)、stop值(一般可在5~20范圍內調節),以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結果。
4.2  結果判斷
陽性:檢測通道Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數增長曲線;
可疑:檢測通道35值≤38,建議重復檢測,如果檢測通道仍為35值≤38,且曲線有明顯的增長曲線, 判定為陽性,否則為陰性;陰性:樣本檢測結果Ct值>38或無Ct值。
5、質控標準
陰性質控品:Ct>38 或無Ct值顯示;
陽性質控品:擴增曲線有明顯指數生長期,且Ct值≤32; 以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。

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