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測定香料中的真菌毒素、 非法著色劑和農藥
閱讀：1052 發布時間：2021-11-30前言 ：香料自古以來就被用于食品的調味和著色。歐洲國家發生過很多香料安全性警 告事件，涉及不同種類的污染物。因此，通過一種多殘留分析方法同時篩查和 定量農藥、真菌毒素以及著色劑的需求越來越迫切。這類分析面臨的主要挑戰 包括復雜的基質、大量的分析物、化合物種類的多樣性，以及分析方法必須覆 蓋寬泛的濃度范圍等。 本應用簡報評估了在動態 MRM 和快速極性切換模式下運行的離子漏斗三重四極桿質譜儀對一系列痕量水平分析物進行準確定量分析的性能。此外，我們還評 估了旨在優化 MRM 間延遲時間的改良版軟件和固件，其能夠在低至 0.5 ms 的駐 留時間內獲取高質量數據。 Agilent 6495B 三重四極桿液質聯用系統具有優異的靈敏度，能夠精準定量高度 稀釋的樣品中的農藥、真菌毒素和著色劑，在降低基質效應的同時提高方法穩 定性。
實驗部分 樣品前處理 黑胡椒和辣椒粉購自當地雜貨店，按 照 EN 15662 QuEChERS 前處理方法， 使用 Agilent BondElut QuEChERS 試劑 盒（部件號 5982-6650）進行提取。 使用 QuEChERS dSPE EMR-Lipid 增強 型脂質去除凈化基質試劑盒（部件 號 5982-1010）進一步純化提取物， 然后進行 Polish 凈化鹽析萃取（部件 號 5982-0102）。最后，向提取物中加 入 2 ppb (10 µg/kg) 安捷倫綜合農藥混 標（部件號 5190-0551）、真菌毒素以 及著色劑標準品 (Sigma)，再用乙腈以 1:5、1:10、1:20、1:50 和 1:100 的比例 稀釋加標后的提取物。 方法設計 使用 Agilent MassHunter 優化軟件優化 五種真菌毒素和九種著色劑的 MRM 離子對，并使用安捷倫農藥觸發式多 反應監測 (tMRM) LC/MS 應用套裝為 每種化合物確定至少兩個 MRM 離子 對及其對應的 MS 條件。采用正離子 和負離子電噴霧電離，在動態 MRM (dMRM) 或 tMRM 模式下通過單次運 行執行分析。主要的 UHPLC 和 dMRM MS 參數如儀器條件表所示。
結果與討論 評估經優化的 MRM 間延遲時間 我們開發了以 100 個 MRM 離子對（代 表 53 種農藥）為分析目標的方法，用 于評估優化了 MRM 間延遲時間的改 良版軟件和固件。圖 1 顯示了四個不 同的駐留時間內兩種農藥的疊加 MRM 色譜圖，表明合適的 MRM 延遲時間 對于在短駐留時間內保持離子信號非 常重要。
方法開發及性能 我們首先采用針對目標真菌毒素和著 色劑化合物進行了優化的新離子對開 發了 MRM 方法。隨后，使用新的化 合物離子對和觀察到的保留時間數據 更新以 250 多種農藥為目標的 dMRM 方法。 UHPLC 與經過優化的 6495B 三重四極桿質譜儀相結合，能夠在大多數分析 物最大殘留* (MRL) 10% 的定量下 限 (LLOQ) 水平對其進行定量分析。在 低至 2 ppt 的 LLOQ 到高至 100 ppb 的定 量上限 (ULOQ) 范圍內，采用 13 個濃 度水平的標樣評估方法的精度和準確 度，每個濃度執行五次重復進樣。所 得結果表明，分析的精度（LLOQ 處的 RSD% < 20%，其余濃度水平 < 15%） 和平均準確度（LLOQ 處為 80%-125%， 其余濃度水平為 85%-115%）都很出色。 校準曲線的相關系數 (R2 ) 大于 0.99。
通過稀釋提取物最大限度降低基 質效應 對復雜樣品提取物進行稀釋能夠最大 限度降低基質效應，使得定量分析更 加準確，同時還能減少液質聯用系統 所受的污染，從而提高分析穩定性。 表 1 顯示了稀釋操作對分析結果的改 善，其中黑胡椒樣品中化合物的回收 率隨著樣品被進一步稀釋而提高。 香料是一類非常具有挑戰性的食品基 質，它們的性質很復雜，因而離子抑 制效應極為顯著。由于觀察到了著色 劑化合物損失，我們不能利用傳統分 散式固相萃取凈化來去除干擾性基質 化合物，這又導致基質效應進一步增 強。因此，稀釋提取物對于降低離子 抑制效應而言十分關鍵，圖 4 中的對 比結果表明，不同類型的香料適用的 稀釋比例差別非常大。 我們所分析的樣品中十分具有挑戰性的 香料基質是黑胡椒。圖 5 表明，要使 化合物回收率達到 > 90% 的可接受標 準，需要使用乙腈以 1:100 的比例稀釋 提取物。6495B 液質聯用系統固有的靈 敏度能夠有效分析以適合比例 1:100 稀釋的黑胡椒樣品，同時仍能檢出大 多數化合物，且峰面積 RSD < 20%。
使用觸發式多反應監測 (tMRM) 進行確證分析 使用 dMRM 方法評估基質效應時， 我們發現辣椒粉的空白提取液（未加 標）中存在 20 多種農藥和真菌毒素。 為了進一步確認此對照樣品中的這些 化合物，我們使用 tMRM 方法，在一 個主要離子對的基礎上采集了多達六個離子對，然后將完整的化合物譜圖 與采用純標準品創建的譜庫進行比 對。定量分析也使用相同的數據。在 圖 6 所示的例子中，以 1:20 比例稀釋的 辣椒粉提取物中赭曲霉毒素 A 和黃曲 霉毒素 B1 的計算結果分別為 28 µg/kg 和 8.1 µg/kg。
結論 • 使用優化的 MRM 間延遲時間能 夠將所用 MRM 駐留時間縮短至 0.5 ms，同時最大限度減小分析 物信號損失 • 真菌毒素和著色劑化合物被成 功納入 UHPLC/MS/MS 農藥方 法的目標分析物中，用于測定 260 余種化合物 • 使用 Agilent 6495B 液質聯用系 統可提高分析靈敏度，精準定 量高度稀釋的香料提取物中的 化合物，同時降低基質效應并 提高方法穩定性 • 本文還給出了香料中真菌毒素 化合物的確證分析所用的 tMRM 采集參數