western blot中脫脂奶粉的作用

封閉

原理：用非抗原的蛋白去封閉膜的蛋白質結合位點，避免標記抗體固定在膜上引起背景增高，常用的封閉液有BSA,脫脂奶粉,明膠, tween-20等,一般脫脂奶粉。

實驗步驟：

5%脫脂奶粉（用1x TBS配制，或1xTBST配制）封閉一晚上 或室溫1~2小時

當一抗為抗磷酸化抗體時，脫脂奶粉由于含有較多磷酸化蛋白，請改為使用BSA。

2，一抗、二抗孵育

原理： 一抗可以與要檢測的蛋白特異結合，二抗可與一抗結合，同時二抗上帶有特異的酶（如辣根過氧化物酶HRP，堿性磷酸酶法AP等 ),標記酶可以分解化學顯色底物產生有顏色的條帶或催化化學發光底物使膠片感光。

實驗步驟：

一抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋一抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時或4度一晚上（抗體濃度及孵育時間需根據不同的抗體做相應調整， 1xTBST，洗膜3次，每次5分鐘。

二抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋二抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時， 1x TBST,洗膜3次，每次5分鐘。