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2018-12-18 閱讀(2719)
Western Blot實驗又稱蛋白質印跡法、免疫印跡試驗。Western Blot是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。Western Blot原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。
在Western Blot實驗中通常需要注意以下幾個問題:
1. 免疫印跡雜交的敏感與檢測系統有關.因此,凝膠電泳時的蛋白上樣量應該保證被檢測抗原量不于太低,如果過低應該重新純化和濃縮使用,或者建議做一次梯度稀釋,上樣電泳后,直接考馬斯亮藍染色選擇較好上樣量,純化和濃縮的蛋白質樣品必須注意鹽的濃度過高,可平衡一下鹽的濃度,如,透析。
2. 形成凝膠的試劑要有足夠的純度,激活劑的濃度適當,不僅可以決定凝膠聚合的速度,也將影響凝膠的質量,聚膠時的溫度也將影響凝膠聚合的速度.因此,建議要根據不同溫度下適量增減激活劑的用量以保證分離膠從加入激活劑起開始出現凝膠凝聚的時間為15-20分鐘,對于濃縮膠較好聚合時間為8-10分鐘開始可見聚合.灌完分離膠加水封閉分離膠與外界氧氣的結合。
3. 未聚合的丙烯酰胺具有神經毒性,操作時應該戴手套防護.梳子插入濃縮膠時,應確保沒有氣泡,可將梳子稍微傾斜插入以減少氣泡的產生,梳子拔出來時應該小心,不要破壞加樣孔,如有加樣孔上的凝膠歪斜可用枕頭插入加樣孔中糾正但要避免枕頭刺入膠內。
4. 電泳槽內加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺,同時建議低電壓短時間的預電泳,清除凝膠內的雜質,疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通(恒壓10-20V,20-30min)。
5. 加樣前樣品應先離心,尤其是長時間放置的樣品,以減少蛋白質帶的拖尾現象。
6. 為避免邊緣效應,可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液。
7. 樣品緩沖液中煮沸的樣品可在-20℃存放數,,但是反復凍融會使蛋白質降解。
8. 為減少蛋白質條帶的擴散,上樣后應盡快進行電泳,電泳結束后也應直接或者轉印。
9. 上樣時,小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。
10. 取出凝膠后應注意分清上下,可用刀片切去凝膠的一角作為標記(如左上角)轉膜時也應用同樣的方法對NC膜做上標記(如左上角)以分清正反面和上下關系。
11. 轉膜時應依次放好NC膜與凝膠所對應的電極,即凝膠對應負極,NC膜對應正極。
