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注意微生物污染

一年

1. 注意無菌操作，盡量避免污染。
2. DNA不應含有蛋白和酚。
3. 為了取得較高的轉染效率，推薦使用在50代以內的細胞進行轉染，轉染前細胞必須處于良好的生長狀態。
4. 高純度的質粒是獲得高轉染效率的必要條件，要確保OD260/OD280≥1.8.
5. 該轉染試劑不應渦旋或離心，宜緩慢晃動混勻。
6. 在體外細胞轉染實驗中，可通過預實驗在轉染試劑：DNA（ug）=2:1~6:1之間選擇比例。
7. 影響轉染效率的因素很多，如細胞類型、細胞狀態及密度、DNA/siRNA轉染量、轉染試劑與DNA/siRNA比例等，應再具體實驗中優化的轉染條件。

DNA轉染（以12孔板為例）：
1. 在轉染前18~24h用消化培養細胞，取適量對數期細胞轉移至新的12孔板中，并將細胞培養板置于37℃ 5% CO2培養箱培養，待細胞密度大70～90%滿時即可進行轉染。后續操作步驟均按12孔板計算，如果轉染器皿不同，請按比例自行調節用量。
2. 在加入待轉染的DNA之前2～4h，加入1ml不含抗生素的培養液，置于37℃ 5% CO2培養箱培養。 也可使用含有血清并含有抗生素的新鮮培養液，但抗生素使某些細胞轉染后出現一定的細胞毒性。
3. 配制染色工作液：取2個無菌離心管，分別加入50ul不含抗生素和血清的培養液，取其中一離心管加入1.6~3ugDNA，輕輕混勻；取另一離心管加入3ul轉染試劑，輕輕混勻。室溫靜置5min，將含有DNA的培養液用微量移液器輕輕加入含有轉染試劑的培養液中，輕輕吹打混勻，室溫靜置20min。
4. 將上述轉染工作液逐滴滴入對應細胞培養液中，輕輕混勻后置于37℃ 5% CO2培養箱培養中培養。
5. 培養4~6h后，更換為含有血清的培養液。對于Hela細胞，推薦在轉染4h更換培養液；對于NIH3T3、 CHO、 HEK293T和 HEK293FT 細胞，推薦在轉染6h更換培養液。
6. 繼續培養24~48h后，觀察或收集細胞或加入適當的篩選藥物如G418等進行穩定細胞株的篩選。

（二）siRNA轉染（以12孔板為例）：
1. 在轉染前18~24h用消化培養細胞，取適量對數期細胞轉移至新的12孔板中，并將細胞培養板置于37℃ 5% CO2培養箱培養，待細胞密度大50～80%滿時即可進行轉染。后續操作步驟均按12孔板計算，如果轉染器皿不同，請按比例自行調節用量。
2. 在加入待轉染的siRNA之前2～4h，加入1ml不含抗生素的培養液，置于37℃ 5% CO2培養箱培養。 也可使用含有血清并含有抗生素的新鮮培養液，但抗生素使某些細胞轉染后出現一定的細胞毒性。
3. 配制染色工作液：取2個無菌離心管，分別加入50ul不含抗生素和血清的培養液，取其中一離心管加入40pmol siRNA，輕輕混勻；取另一離心管加入2ul轉染試劑，輕輕混勻。室溫靜置5min，將含有siRNA的培養液用微量移液器輕輕加入含有轉染試劑的培養液中，輕輕吹打混勻，室溫靜置20min。
4. 將上述轉染工作液逐滴滴入對應細胞培養液中，輕輕混勻后置于37℃ 5% CO2培養箱培養中培養。
5. 培養4~6h后，更換為含有血清的培養液。對于Hela細胞，推薦在轉染4h更換培養液；對于NIH3T3、 CHO、 HEK293T和 HEK293FT 細胞，推薦在轉染6h更換培養液。
6. 繼續培養24~48h后，觀察或收集細胞。