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豬主動脈內皮細胞

一、細胞基本屬性

 

培養基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

包被條件：PLL(0.1mg/ml)，明膠(0.1%)

傳代特性：可傳2-3代

消化液：0.25%胰dan白酶

培養條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

細胞簡介：豬主動脈內皮細胞分離自主動脈組織；主動脈是體循環的動脈主干。其運行路徑為：升主動脈起于左心室，至右側第2胸肋關節高度移行為主動脈弓，弓行向左后至第4胸椎體下緣移行為降主動脈；在第12胸椎體高度穿膈的主動脈裂孔移行為腹主動脈，以上為胸主動脈，至第4腰椎體下緣分為左、右髂總動脈；髂總動脈在骶髂關節高度分為髂內、外動脈。主動脈內皮細胞是覆蓋在主動脈內面的單層細胞，可分泌一系列血管活性物質而保持血管穩態，當其受到炎癥或其它因素刺激后穩態被破壞而導致一些心血管疾病的發生。因此，主動脈內皮細胞已成為研究心血管疾病發病機制及治療藥物的工具。內皮細胞或血管內皮是一薄層的專門上皮細胞，由一層扁平細胞所組成。它形成血管的內壁，是血管管腔內血液及其他血管壁(單層鱗狀上皮)的接口。內皮細胞是沿著整個循環系統，由心臟直至小的微血管。
原代細胞分離培養的思路：

取材--分離--培養--鑒定

首先將組織從機體中取出，經胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細胞，再在合適的培養基中培養，使細胞繁殖到一定系數后進行細胞鑒定。

實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養皿中。

四、用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質。

五、大腦皮質放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養液懸浮混勻，鋪于經離心形成連續梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養液(20％FBS，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養皿中，置于37℃、5％CO2培養箱內靜置培養24h后更換不含素的混合培養基，隨后隔天換液。

注意事項：

1. 培養基于4℃條件下可保存3-6個月。

2. 在細胞培養過程中，請注意保持無菌操作。

3. 傳代培養過程中，yi酶消化時間不宜過長，否則會影響細胞貼壁及其生長狀態。

4. 建議客戶收到細胞后前3天每個倍數各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態，便于和技術部溝通；由于運輸的原因，個別敏感細胞會出現不穩定的情況，請及時和我們聯系，詳盡告知細胞的具體情況，以便我們的技術人員跟蹤、回訪直至問題得到解決。
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