裂解和溶解：

為了使蛋白質(zhì)能夠進入分離凝膠，它們必須是可溶的形式。樣品制備的階段是裂解。

通過裂解提取細胞內(nèi)表達的蛋白質(zhì)，裂解會破壞細胞的質(zhì)膜和/或細胞壁，以釋放蛋白質(zhì)。細胞外表達（分泌）的蛋白質(zhì)不需要裂解，盡管可以對細胞進行處理和加載以觀察由于合成不當而捕獲的任何蛋白質(zhì)。

Jackson公司大規(guī)模蛋白質(zhì)純化——提取方法：

可以通過蛋白質(zhì)印跡分析來自各種來源的蛋白質(zhì)。樣品可能來自蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)，例如哺乳動物或細菌細胞培養(yǎng)物，或來自臨床組織樣品，每種都需要不同的處理來產(chǎn)生有用的印跡。

用于蛋白質(zhì)提取的方法取決于樣品的性質(zhì)。蛋白質(zhì)表達在哺乳動物、昆蟲、細菌和酵母等不同類型的細胞中進行，一些樣本可能來自組織；這些具有需要不同處理的結(jié)構(gòu)特性。

分泌蛋白：

在哺乳動物或昆蟲細胞系統(tǒng)中表達的一些蛋白質(zhì)也可能在上清液中表達，不需要從細胞中提取。一個好的提示是保留上清液樣本，并在篩選表達時將其加載到細胞裂解液旁邊的凝膠上。

Jackson公司篩選和處理：

蛋白質(zhì)表達通常通過蛋白質(zhì)印跡進行篩選。例如，幾個克隆的表達可以相互比較，或者它們在不同表達系統(tǒng)中的表達。在這些篩選試驗中，從蛋白質(zhì)制備物中取出樣品并上樣用于分析。通常這會將上清液與細胞沉淀進行比較，以定位表達發(fā)生的位置。考馬斯染色觀察到的總蛋白質(zhì)可以與蛋白質(zhì)印跡中特異性提取的感興趣蛋白質(zhì)的表達進行比較。

篩選試驗中進行的基本處理可能不能代表最終表達（prep）是如何處理以供最終使用的，例如晶體學試驗所需的仔細純化步驟。

圖 1：在一系列細胞裂解物中檢測 His 標簽蛋白。以 100 ng 的濃度將 C 末端 His-Tagged 蛋白添加到細胞裂解物中。HEK 293、CHO、BL21大腸桿菌和 Sf9 昆蟲細胞的細胞裂解物被還原并在 100°C 下煮沸 5 分鐘，并以 9 μg/孔的速度加載到串聯(lián) SDS 凝膠中。

A. 蛋白質(zhì)印跡。將凝膠電印跡到硝酸纖維素膜上，用 PBS/0.2% Tween 20 中的 5% BSA 封閉，并用 Jackson ImmunoResearch 的 HRP Rabbit Anti-His Tag ( 300-035-240 ) 以 1:20K 稀釋度進行探測，并使用數(shù)字成像儀進行可視化。

B. 凝膠用考馬斯染色。

Jackson公司裂解緩沖液：

裂解緩沖液的目的是破壞細胞膜以釋放蛋白質(zhì)。裂解緩沖液通常包括破壞細胞膜脂質(zhì)雙層并形成膠束的去污劑。有許多緩沖液配方已經(jīng)過驗證，可用于不同的細胞類型或蛋白質(zhì)表達位置，例如含有去污劑的 RIPA 或 NP-40。材料的加工應(yīng)在冰上進行，以盡量減少可能改變蛋白質(zhì)的細胞成分的降解和變性。

蛋白酶及其抑制：

溶解方法，例如涉及對細胞進行機械破壞的過程，會導(dǎo)致細胞內(nèi)蛋白酶的釋放。這些蛋白酶可以消化和截斷感興趣的蛋白質(zhì)，這可能會導(dǎo)致在印跡上觀察到多個條帶。

蛋白質(zhì)對蛋白酶的敏感性取決于其氨基酸組成，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的抵抗力低于細胞表面或細胞外蛋白質(zhì)。當被去污劑溶解時，膜蛋白特別容易被蛋白酶降解。生物信息學工具可用于提前預(yù)測蛋白質(zhì)對蛋白水解的敏感性。蛋白酶抑制劑可用于防止蛋白水解；這些可以是化學和酶抑制劑的混合物，可以在添加到細胞或要儲存蛋白質(zhì)的緩沖液之前添加到裂解緩沖液中。

有一系列抑制劑可以阻止常見的絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶以及氨肽酶和金屬蛋白酶。不同的表達系統(tǒng)或?qū)Φ鞍踪|(zhì)活性抑制的敏感性可能會阻止某些抑制劑的使用。蛋白酶抑制劑的專有混合物通常是可用的，或者可以使用單一試劑。

可以在緩沖液中小心使用疊氮化物以防止細菌生長，細菌也可能是蛋白酶的來源。細胞裂解后可能會發(fā)生去磷酸化。如果磷酸化蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)印跡的目標，則磷酸酶抑制劑（如釩酸鈉）也應(yīng)添加到裂解緩沖液中。在整個樣品制備過程中，樣品應(yīng)保持在冰上，以盡量減少降解和去磷酸化的可能性。（表1）

Jackson公司專注于親和純化的二抗和純化免疫球蛋白研究，服務(wù)領(lǐng)域覆蓋各大學科研所和醫(yī)院里的動物研究以及生物醫(yī)學研究機構(gòu)的科學家。艾美捷科技是Jackson公司的中國代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。