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技術(shù)文章

3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)生化檢測試劑盒測定步驟

閱讀:318          發(fā)布時間:2024-3-6

3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)生化檢測試劑盒測定步驟:


1、分光光度計預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。


2、將試劑二在37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min以上。


3、操作表:



試劑名稱(μL)


測定孔


樣本


20


試劑二


760


試劑三


10


試劑四


10




將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中,混勻后立即在340 nm波長下記錄初始吸光度A1和反應(yīng)1min后的吸光度A2,計算ΔA=A1-A2。


注意:若A1-A2大于0.5,需將樣本用提取液稀釋,使A1-A2小于0.5,可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。


NAD-MDH活力單位的計算:


1、血清(漿)NAD-MDH活力的計算


單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。 


NAD-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=6430×ΔA


2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NAD-MDH活力的計算:


(1)按樣本蛋白濃度計算:


單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。


NAD-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr


(2)按樣本鮮重計算:


單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。


NAD-MDH(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T =6430×ΔA÷W


(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:


單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。


NAD-MDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(2000×V樣÷V樣總)÷T=3.215×ΔA


V反總:反應(yīng)體系總體積,8×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,1 min;W:樣本質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;2000:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),2000萬。


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