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WB Trouble Shooting

閱讀:2400      發布時間:2018-3-20
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問題一:轉膜不充分
可能的原因 驗證或解決方法
膜沒有*均勻濕透 使用100%甲醇浸透膜
靶蛋白分子量小于10kDa 選擇小孔徑的膜,縮短轉移時間
靶蛋白等電點等于或接近轉移緩沖液PH值 可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液(pH10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液
甲醇濃度過高 過高甲醇濃度濃度會導致蛋白質與SDS分離,從而沉淀在凝膠中,同時會使凝膠收縮或變硬,從而抑制高分子量蛋白的轉移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替
轉移時間不夠 對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間

 

問題二:背景高
可能的原因 驗證或解決方法
膜沒有*均勻濕透 使用100%甲醇浸透膜
洗膜不充分 增加洗液體積和洗滌次數
封閉不充分 增加封閉液孵育時間,或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑(脫脂奶粉,BSA,酪蛋白等)
二抗濃度過高 降低二抗濃度
檢測過程中膜干燥 保證充分的反應液,避免出現干膜現象
曝光過度 縮短曝光時間
抗體與封閉蛋白有交叉反應 檢測抗體與封閉蛋白的交叉反應性,選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應
二抗的非特異性背景 增加一個二抗對照:不加一抗,其他操作過程不變,即可驗證背景是否有二抗系統來源。選擇其他二抗(特異性更強的,只針對重連的)

 

問題三:無信號
可能的原因 驗證或解決方法
抗體染色不充分 增加抗體濃度,延長孵育時間
酶失活 直接將酶和底物進行混合你,如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內。有活性的酶聯物
標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 設置陽性對照,如果陽性對照,如果陽性對照有結果,但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加樣本上樣量解決靶蛋白含量低的原因
試劑之間不匹配 一抗與標本種屬,一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性
一抗失效 選擇有效期內抗體;并選擇現配現用的工作液
HRP抑制劑 所用溶液和容器中避免含有*

 

問題四:弱信號
可能的原因 驗證或解決辦法
抗體染色不充分 增加抗體濃度,延長孵育時間
酶活性降低 直接將酶和底物進行混合,如果顯色弱則說明酶活性降低了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物
標本中靶蛋白含量太低 增加標本上樣量
洗膜過度 縮短洗滌時間和次數
抗體活性降低 選擇在有效期內的抗體,工作液現配現用,避免長時間放置
蛋白轉移不充分 見上述
封閉過度 較少封閉劑的量或縮短時間;更換不同封閉劑類型
曝光時間過短 延長曝光時間
HRP抑制劑 所用溶液和容器中避免含有疊氮鈉

 

問題五:非特異性條帶(多條帶)
可能的原因 驗證或解決辦法
二抗的非特異性結合 增加一個二抗對照:不加一抗,其他操作過程不變,即可驗證背景是否由二抗系統來源。選擇其他二抗(特異性更強的,只針對重鏈的)
一抗的特異性不夠 使用單克隆或者親和純化的抗體,保證抗體的特異性
蛋白降解 使用新鮮制備的抗體,并使用蛋白酶抑制劑
抗體濃度過高 降低抗體(一抗、二抗)濃度,可以減少非特異性條帶
不同剪切體存在 有些來源于同一基因的蛋白有不同的剪切方法,每個剪切方式得到的蛋白大小都是不同的
細胞傳代過多導致蛋白變異 使用原代或傳代少的細胞作對照
蛋白上樣量過大 降低上樣量

 

問題六:條帶大小不對
可能的原因 驗證或解決辦法
二聚體或多聚體存在 增加蛋白質變性過程及強度
翻譯后剪切 比如很多蛋白是以前體蛋白的形式合成的,在執行功能是需要進行剪切成活化的形式,如procaspases
相對電荷 氨基酸的組成(charged vs non-charged)
蛋白修飾 比如氨基化、磷酸化等修飾狀態會導致蛋白分子量增加

 

問題七:背景有黑色斑點
可能的原因 驗證或解決方法
封閉試劑中有聚集體 使用前過濾封閉試劑
抗體和封閉試劑反應 使用前過濾封閉試劑
HRP偶聯二抗中有聚集體 過濾二抗試劑,去除聚集體

 

問題八:背景有不均勻的白色斑點
可能的原因 驗證或解決方法
轉膜過程中有氣泡產生 仔細檢查,避免存在氣泡
抗體分布不均勻 孵育抗體時使用搖床

 

問題九:膜出現反像(白色帶)
可能的原因 驗證或解決方式
HRP含量過高 降低酶聯二抗的濃度

 

問題十:微小條帶
可能的原因 驗證或解決方法
電泳速度過快 減少電壓等減慢電泳速度
電泳溫度過高 在冷室或者冰浴中進行電泳,改變電泳PH值

 

問題十一:Marker變黑色
可能的原因 驗證或解決方法
抗體和Marker蛋白反應 在Maeker和sample之間空出一個孔不上樣

 

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