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上海申知心生物科技有限公司
主營產品： 高血脂癥動物模型,心血管疾病動物模型,缺血性心臟病動物模型 |
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免疫熒光
細胞免疫熒光染色
免疫熒光：1.材料準備
1)蓋玻片.載玻片
蓋玻片 水洗 浸泡于75％的乙醇溶液
超聲波 泡酸
載玻片 水洗 無水乙醇浸泡 烘干
2）試劑
a.固定液: 4％甲醛， 4％多聚甲醛（PBS，72度溶解）
b.透膜液：0.2％或0.3％triton X-100, 甲醇＋丙酮（V：V＝1：1）
c.封閉液：5％BSA
以上試劑除甲醇＋丙酮外均用PBS配制
d.一抗：Rabit-anti-HA（1:500） ,Mouse-anti-myc（ 1:500）,
Mouse-anti-flag（1:1500),
e.二抗：
Goat-anti-Rabbit FITC(1:500) , Goat-anti-Rabbit-Mouse Texas(1:500）
一抗二抗 均用封閉液稀釋
f. Hoechst 5ug/ml PBS稀釋
g. 90％甘油溶于PBS
h . 指甲油
2. 蓋玻片處理
在細胞培養之前為了讓某些細胞（例如293，293T）的貼壁性能提高需對蓋玻片進行處理，常用的處理方法有：
A：凝膠（gelatin）處理：
1.配制2%的凝膠水溶液，高壓滅菌（同時也有助于凝膠的溶解）
2.將適量蓋玻片（一般不超過40片）放入10cm的細胞培養盤
3.加入10ml 2%的凝膠溶液放在脫色搖床上，在室溫下shake1小時。
4.將200ul的25％的異戊二醛加到10ml的新配制的1xPBS
5.吸去凝膠溶液，加入新配制的異戊二醛溶液，室溫下搖15分鐘。
6.用PBS洗5次，每次5分鐘。
7.將蓋玻片放在30mm盤或者是六空板，UV照射1小時，備用。
B：多聚賴氨酸處理
1.將洗干靜的蓋玻片放在40 μg/ml多聚賴氨酸處理溶液中，室溫下浸泡大約1小時
2.自來水沖洗1小時，然后用蒸餾水浸泡3次，每次5分鐘。
3 UV照射3小時，備用。
3.細胞培養
根據細胞的不同生長速度而調節分細胞時的密度，一般說來，在細胞固定前其密度達到1X106
為宜1X106
4.轉染
為了檢測某種蛋白分子的細胞內定位或者觀察兩種蛋白分子在細胞內的共定位，常常將某基因轉染進入細胞內，常用的有PEI，磷酸鈣轉染法等。
5.染色
1).轉染24hr后，吸去培養液，PBS洗一次
2).固定： 4％甲醛或 4％多聚甲醛， 20min， PBS洗二次
3).透膜：a. 0.2％或0.3％triton X-100, RT，10min ,PBS洗二次
b.甲醇＋丙酮（V：V＝1：1）, -20 °, 20min, PBS洗三次
4).封閉：封閉液800ul， RT，60min （時間可以長些，4° ）
5).一抗：100ul ,RT ，1hr 或者37 °，45min，PBS洗5次，5min/time
6).二抗：100ul ,RT ，1hr 或者37 °，45min，PBS洗2次，5min/time
7).染核：Hoechst，200ul,10min, PBS洗4次，5min/time
8).封片：9ul 90％甘油. 不要留有氣泡。
6. 熒光顯微鏡觀察
