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N端乙酰化和肉豆蔻酰化是蛋白中最常見(jiàn)的翻譯后修飾之一，它們參與了蛋白的相互作用和亞細(xì)胞定位。為了闡明這些翻譯后修飾的重要性，需要比較分析修飾蛋白和未修飾蛋白。但是，在使用大腸桿菌等活細(xì)胞制備蛋白的常規(guī)方法中，受細(xì)胞中固有的修飾酶影響，難以控制和制備未修飾蛋白和修飾蛋白。

在本研究中，使用僅由參與蛋白合成的因子組成的PURE system（產(chǎn)品名稱：PUREfrex^®），探討制備N(xiāo)端修飾目標(biāo)蛋白的方法，并以wan全可控的狀態(tài)成功合成了乙酰化或肉豆蔻酰化的蛋白。

◆由未甲酰化的初始蛋氨酸合成蛋白

在使用常規(guī)PURE system的蛋白合成中，與大腸桿菌內(nèi)的翻譯反應(yīng)相同，由甲酰化的蛋氨酸進(jìn)行翻譯。但是，如果初始蛋氨酸的氨基被甲酰化，則不會(huì)發(fā)生N端修飾。因此，使用不含甲酰基供體（10-Formyl-tetrahydrofolate10-CHO-THF）的PURE system進(jìn)行蛋白合成。結(jié)果表明，盡管不使用10-CHO-THF后合成效率有所降低，但仍成功合成了目標(biāo)蛋白。

◆NatB的N端乙酰化

酵母NatB是一種由yNaa20和yNaa25組成的異源二聚體酶，它能將乙酰CoA的乙酰基轉(zhuǎn)移至未甲酰化的初始蛋氨酸的氨基上。在不含10-CHO-THF的PURE system中加入目標(biāo)蛋白、yNaa20及yNaa25的模板DNA和乙酰CoA進(jìn)行反應(yīng)。通過(guò)質(zhì)譜分析合成的目標(biāo)蛋白的N端肽，確認(rèn)添加NatB DNA后被乙酰化。

◆NatA的N端乙酰化

酵母NatA是一種由yNaa10和yNaa15組成的異源二聚體酶，它將乙酰CoA的乙酰基轉(zhuǎn)移至methionine aminopeptidase（MAP）切割初始蛋氨酸時(shí)暴露的第二個(gè)氨基酸的氨基上。因此，使用NatA進(jìn)行乙酰化時(shí)，必須通過(guò)MAP去除N端的初始蛋氨酸。由于MAP會(huì)切割未甲酰化的初始蛋氨酸，因在不含10-CHO-THF的PURE system中添加目標(biāo)蛋白、yNaa10、yNaa15的模板DNA、純化MAP和乙酰CoA進(jìn)行反應(yīng)。通過(guò)質(zhì)譜分析合成目標(biāo)蛋白的N端肽，確認(rèn)添加NatA DNA后被乙酰化。

◆NMT的N端肉豆蔻酰化

NMT是一種可將MAP切割初始蛋氨酸后暴露出的第二個(gè)甘氨酸的氨基進(jìn)行肉豆蔻酰化的酶。由于底物肉豆蔻酰 CoA會(huì)抑制蛋白合成反應(yīng)，因此需先在不含10-CHO-THF的PURE system中分別合成目標(biāo)蛋白和NMT。然后，將分別合成的目標(biāo)蛋白、NMT及肉豆蔻酰CoA混合，進(jìn)行肉豆蔻酰化反應(yīng)。通過(guò)質(zhì)譜分析合成目標(biāo)蛋白的N端肽，確認(rèn)添加NMT后被肉豆蔻酰化。

此外，在脂質(zhì)體中進(jìn)行上述的肉豆蔻酰化反應(yīng)時(shí)，可觀察到肉豆蔻酰化的蛋白在脂質(zhì)體膜的定位狀態(tài)。

● 實(shí)驗(yàn)步驟概述（A）

● 去除初始蛋氨酸的GFP通過(guò)hNMT1（Δ80）在脂質(zhì)體內(nèi)被肉豆蔻酰化，還可觀察到其向脂質(zhì)體膜遷移（B）

● 根據(jù)3、6、9、12和24 h的反應(yīng)時(shí)間繪制GFP膜定位的比率（C）

● 未添加肉豆蔻酰-CoA（D）或hNMT1（Δ80）基因（E）時(shí)，無(wú)法觀察到GFP的膜定位

◆總結(jié)

該項(xiàng)研究結(jié)果表明，通過(guò)使用PURE system，可在wan全可控下制備N(xiāo)端修飾蛋白，還可以確認(rèn)翻譯后修飾的合成蛋白在脂質(zhì)體膜上的定位。此外，PURE system還能合成修飾酶，無(wú)需純化即可用于修飾反應(yīng)。該方法也適用于其他修飾酶，可以簡(jiǎn)便地進(jìn)行各種翻譯后修飾反應(yīng)的分析和應(yīng)用。

該項(xiàng)研究是GeneFrontier、東京工業(yè)大學(xué)和海洋研究開(kāi)發(fā)機(jī)構(gòu)（JAMSTEC）的共同研究。論文發(fā)表在ACS Synthetic Biology，可通過(guò)以下鏈接免費(fèi)下載：
pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.3c00191

“Regulated N-Terminal Modification of Proteins Synthesized Using a Reconstituted Cell-Free Protein Synthesis System"
ACS Synthetic Biology (2023) 12, 1935-1942

相關(guān)產(chǎn)品：

PUREfrex^® 無(wú)細(xì)胞蛋白合成試劑盒：http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/1610.html