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強干擾樣品中的內毒素檢測方法
閱讀：568 發布時間：2023-4-20
注射類藥物產品的內毒素污染可導致嚴重后果，包括發燒、敗血癥和敗血性休克。因此，內毒素檢測已成為注射類處方藥、醫療器械生產和質量控制的必要檢測。
鱟試劑（LAL) 檢測是內毒素評估的最佳成熟檢測方式1)。其主要采用鱟的變形細胞提取物與待檢測內毒素污染樣品進行孵育，如果分析樣品中存在內毒素，則會形成凝塊。傳統的LAL檢測方法是定性的凝膠法。隨后，開發了定量LAL檢測方法，包括顯色法和濁度法。
LAL檢測的準確性和可靠性已得到證實。然而，被測產品、檢測劑成分、環境甚至容器相關的各種因素可能會導致測試難以進行或出現誤導性結果，其中包括樣品干擾或內毒素掩蔽劑2-4)。可能干擾LAL檢測的因素包括化學抑制劑（如乙二胺四乙酸，EDTA）；變性劑（如濃酸、堿、無機鹽或有機溶劑）；堿化乙醇分子；超出最佳范圍的pH值；內毒素掩蔽劑（賦形劑、表面活性劑、螯合劑或 N-二甲基氧化胺等物質）；或內毒素被容器表面吸收1)。對于醫療器械，抗凝涂層、重金屬含量或微粒的存在可能會干擾測試結果2)。對于使用顯色法檢測的樣品，與 鱟試劑接觸時，檢測混合物中的特定顏色也會干擾測試結果1)。對于用濁度法檢測的樣品，樣品中的渾濁或懸浮也可能導致干擾1)。
以下整理了內毒素檢測中不同的抗干擾方法，以降低樣品干擾或內毒素掩蔽的因素給實驗結果帶來的影響：
◆適當稀釋樣品
如果在LAL檢測過程中沒有干擾或增強效應，可以對未稀釋的樣品進行檢測。如果樣品存在干擾LAL檢測的成分，則應稀釋樣品以減少干擾或增強。建議確定最大稀釋倍數，保證減少干擾效應但仍可進行內毒素測定2)。
◆消化、使用緩沖液、過濾或離心
這些都是降低醫療設備檢測干擾的潛在處理方法2)。具體選用哪種操作應取決于對實驗干擾因素的評估和對檢測條件的驗證。
◆保持最佳pH范圍
LAL檢測的最佳 pH 范圍在6.0–8.0范圍內，檢測條件應保持在此范圍內以確保結果一致。
◆保證樣品的均勻性
懸浮樣品可能會導致干擾問題。因此，應盡量保證樣品的均勻性。在這種情況下，不建議混合來自制造過程不同階段的樣品，因為難以確保不同階段產品可以混合均勻2)。
◆調整混合樣本的最大有效稀釋倍數（MVD）
某些情況下，小體積單位的成品藥可能會合并成復合樣品，再進行LAL檢測。在這種情況下，應通過將單個樣品計算的的MVD除以合并樣本的總數，按比例將MVD調整為較低值2)。
◆使用在LAL 檢測經過充分驗證的試劑和樣品容器
由于鱟試劑和樣品容器的成分也可能對檢測結果產生負面影響4)，因此建議使用經充分驗證的鱟檢測和樣品容器。
◆相關產品
內毒素特異性鱟試劑PYROSTAR™ ES-F 系列（凝膠法/動態濁度法）
內毒素特異性鱟試劑Limulus Color KY（動態顯色法）
◆參考文獻
1) Wheeler, A. Comparing endotoxin detection methods. Pharmaceutical Technology 2017;41:58–62.
2) FDA. Guidance for industry: pyrogen and endotoxins testing: questions and answers. June 2012.
3) Reich J, Lang P, Grallert H, Motschmann H. Masking of endotoxin in surfactant samples: Effects on Limulus-based detection systems.
Biologicals. 2016;44(5):417-22. doi: 10.1016/j.biologicals.2016.04.012.
4) Bech ?rving R, Carpenter B, Roth S, Reich J, Kallipolitis B, Sonne-Hansen J. Bacterial Endotoxin Testing-Fast Endotoxin Masking Kinetics
in the Presence of Lauryldimethylamine Oxide. Microorganisms. 2020;8(11):1728. doi: 10.3390/microorganisms8111728.