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激光共聚焦顯微鏡定位細胞熒光標記的工作原理
閱讀：2993 發布時間：2020-12-28
激光共聚焦顯微鏡采用激光為激發光源，優點是得到高的分辨率，記錄鈣離子三維空間分布；雙光子熒光顯微鏡則采用紅外激光作為光源，具有高空間分辨率，而且噪聲比較低。共聚焦顯微鏡可清晰地顯示相對較厚的(厚達幾百微米)標本內部結構圖像，尤其適于檢測熒光標本。
使用傳統的寬視場熒光顯微鏡時，由于標本全層的熒光團都被光照到，而且它不僅收集焦平面上的熒光信號，還收集焦平面上下方的熒光信號，所以用它來觀察較厚熒光標本時，圖像模糊且反差小。而激光共聚焦顯微鏡則選擇性收集來自標本內部相當于單一焦平面的光切面(約lgm)的光線。
由于共聚焦顯微鏡基本沒有來自離焦區的光線，所以它所觀察的焦平面內結構要比傳統顯微鏡清晰得多。一系列不同厚度的光切面可使標本的三維圖像得以重建。在檢測組織片或完整的小生物(如果蠅和斑馬魚的胚胎)中的熒光染色細胞時，可選用共聚焦顯微鏡。
共聚焦顯微鏡也可用來定位分離細胞內的熒光標記分子。由于其靈敏度較高，甚至可以用來監控活體標本內的熒光，使得示蹤熒光探針如綠色熒光蛋白的利用成為可能。此外，有些型號的共聚焦顯微鏡加以調整后，可用于光漂白實驗及光敏化“籠鎖”分子(紫外光照射前為失活狀態)。
激光共聚焦顯微鏡通過聚焦光束掃描標本及熒光信號的收集來實現光切，所收集的熒光信號為通過空間濾波器(-g-為針孔式)的所有光點，而空間濾波器是用來阻擋來自標本離焦區域的信號的。
激光共聚焦顯微鏡進行光切的結構基礎。光源(常為激光器)均勻地照亮物鏡后焦平面，并將光線聚焦在標本內的衍射極點上。盡管焦平面上下方也能被照到，不過焦點照射強度大。由入射光激發的熒光分子向各個方向發出熒光。物鏡收集的熒光聚焦在像平面上，它與標本內的焦平面是共軛的(共焦的)。像平面內的針孔孔徑允許標本內照明點發出的熒光通過并到達檢測儀，但卻阻止來自離焦區域的光線通過。