溶藻弧菌染料法熒光定量PCR試劑盒

Vibrio alginolyticus

產品及特點

巨細胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）是一種皰疹病毒組 DNA 病毒。亦稱細
胞包涵體病毒，由于感染的細胞腫大，并具有巨大的核內包涵體。巨細胞病毒分布廣泛，其他動物皆可遭受感染，引起以生殖泌尿系統，中樞神經系統和肝臟疾患為主的各系統感染，從輕微無癥狀感染直到嚴重缺陷或死亡。對于孕婦或有慢性消耗性疾病、免疫力低下等患者要注意保護。本公司開發巨細胞病毒染料法熒光定量PCR試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 特異性高，引物是根據鸚鵡熱衣原體高度保守區設計,不會擴增其他微生物。

3. 引物和擴增體系經過優化，靈敏性比常規 PCR 高 100 倍。

4. 提供無傳染性的 PCR 陽性對照，便于區分假陰性樣品。

5. 一管式操作，熒光 PCR 檢測，不容易產生環境污染。

6. 本產品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR。

溶藻弧菌染料法熒光定量PCR試劑盒規格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）
1.注意：由于陽性對照濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA段作為陽性對照。
2.標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4.在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
5.換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
7.重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8.如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL PCR陽性對照的10000倍稀釋的（稀釋后濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝，可以將10μL原液加入到990μL 自備TE溶液中，充分混勻，此為100倍稀釋液。再取10μL此稀釋液加入到990μL 自備TE溶液中，充分混勻，此為10000倍稀釋液）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）。可以用水作為制備的陰性對照。制備所得成為樣品DNA。
9.用自選方法純化N+2個樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數核酸提取試劑盒兼容。
三、設置qPCR反應（20 μL體系，在樣品制備室進行）
10.如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號陽性對照稀釋液，濃度為14810拷貝/μL）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個標曲反應縮減成1個，其余不變。
11.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

12.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR（具體PCR參數可以根據儀器不同而自行優化）。

四、數據處理
13.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品cDNA濃度的log值，再推算出其濃度。
14如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于36。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于36則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-36之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于36則為陰性，如果小于35，則為陽性