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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號(hào)	XY-0459	應(yīng)用領(lǐng)域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴(kuò)增效率、更高的擴(kuò)增靈敏度、更高的擴(kuò)增特異性。

單核細(xì)胞增生李斯特菌探針法定量PCR試劑盒

Listeria monocytogenes

產(chǎn)品及特點(diǎn)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)屬乳酸桿菌科，為革蘭氏陽性小桿菌，可以污染食品，導(dǎo)致李斯特病的發(fā)病率日趨上升，臨床表現(xiàn)主要有腦膜炎、敗血性肉芽腫、淋巴結(jié)腫大等。本病遍及世界各地，是人畜共患的傳染病。人類感染有增多趨勢，特別是新生兒、老年人、孕婦及免疫功能低下者易感性更高。對食品中的單增利斯特菌做出快速的檢測和鑒定，是預(yù)防利斯特病的有效方法，因此單核細(xì)胞增生李斯特菌的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。熒光定量PCR是檢測傳染性疾病的主流技術(shù)，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)人單核細(xì)胞增生李斯特菌高度保守的VP1區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他微生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

單核細(xì)胞增生李斯特菌探針法定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

編號(hào)	成分	規(guī)格
試劑一	2×Probe qRT-PCR MagicMix	500 μL（本色蓋）
試劑二	熒光 PCR 模板稀釋液	1 mL（黃蓋）
試劑三	單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR引物	100 μL（白蓋）
試劑四	單核細(xì)胞增生李斯特菌qPCR探針	50 μL（棕色管）
試劑五	單核細(xì)胞增生李斯特菌陽性對照2.0 (1×10E8拷貝/μL)	50 μL （紅蓋）
試劑六	天凈沙核酸釋釋劑（試用裝）	50次（試用裝）
試劑七	使用手冊	1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

自備試劑樣品 DNA。

使用方法 一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

7. 如果有 N 個(gè)樣品，設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性對照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。

三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè) 用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對照（用第 4 號(hào)管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：

成分	樣品管 N+2個(gè)	PCR陰性對照管	標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管（2-7管）
2×Probe qPCR MagicMix（本色蓋）	10 μL	10 μL	各10 μL
單核細(xì)胞增生李斯特菌 qPCR探針（綠蓋）	2 μL	2 μL	各2 μL
伊氏李斯特菌 PCR引物混合液（白蓋）	2 μL	2 μL	各2 μL
待測樣品DNA模板	6 μL	不加	不加
第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7號(hào)）	不加	不加	各6μL（2號(hào)樣到2號(hào)管，3號(hào)樣到3號(hào)管…）

11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：

過程	溫度	時(shí)間
預(yù)變性	94℃	5 min
PCR反應(yīng) （40個(gè)循環(huán)）	94℃	0.5 min
	50℃	0.5 min（采集FAM通道的熒光信號(hào)）
	72℃	0.5 min
后延伸	72℃	10min

五、數(shù)據(jù)處理
12.以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
六、電泳檢測
13.如果有必要電泳確認(rèn)，可取10-20μL PCR產(chǎn)物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產(chǎn)物的大小為400 bp。但電泳非常容易污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境，建議不輕易采納。